TREM-1在真菌性角膜炎发病机制中的作用探究.pdfVIP

摘 要 目的：探讨髓样细胞表达的激发受体-1 (triggering receptor expressed on myeloid ce s-1, TREM-1)在真菌性角膜炎中的表达及其作用的分子机制。 方法：分别以真菌性角膜炎患者、真菌性角膜炎动物模型为对象研宄TREM-1在机 体中的表达规律；体外培养人角膜上皮细胞，研 宄 TREM-1在真菌感染的人角膜上 皮细胞中的表达和调控机制。实验分为三部分：（1 ) 选 择 2012年 9 月 至 2013年 10月在青岛大学附属医院眼科就诊的真菌性角膜炎初诊患者25例 （25眼)为患者实 验组，并根据角膜溃疡炎症反应程度再分为轻度炎症组、中度炎症组和重度炎症组， 收集角膜病灶周边角膜上皮组织；制作角膜植片后剩余的周边角膜的健康供体5 例 #5眼) 为患者对照组，收集植片外围角膜缘2mm内角膜上皮；RT-PCR检测各组角膜 上皮中TREM-1的表达及其与炎症反应程度的关系。健康Wistar大鼠随机分为空白 对 照 组 （角膜未予任何处理）、损伤对照组（刮除角膜上皮后仅覆盖角膜接触镜， 不接种真菌）和真菌感染组（刮除角膜上皮后覆盖角膜接触镜，接种真菌），根据 角膜感染程度进行评分；刮取各组角膜上皮行RT-PCR、Western b lo t 检测 TREM-1 的表达及其与角膜感染程度的关系；完整摘除角膜组织，免疫荧光染色检测TREM-1 在角膜中的定位表达。（2 ) 体外培养人永生化角膜上皮细胞，分别加入烟曲霉菌菌 丝刺激液、烟曲霉菌孢子刺激液，RT-PCR检测不同时间点角膜上皮细胞中TREM-1 的表达，筛选作用显著的刺激液，Western b lo t 检测该刺激液对TREM-1蛋白表达 的影响；RT-PCR检测不同浓度LP17 (TREM-1选择性抑制剂）预处理后烟曲霉菌刺 激液诱导的角膜上皮细胞TREM-1表达改变以及TREM-1阻断对烟曲霉菌刺激液诱导 的角膜上皮细胞炎症因子分泌的影响。（3)研宄 TREM-1与 T o 样受体-4(To like receptor-4 ，TLR-4)之间的协同作用，分别使用TREM-1抑制剂 LP17 、TLR-4抑制 剂 CLI-095和 MyD88 (TLR信号通路下游因子）抑制剂 ST2825预处理体外培养的人 永生化角膜上皮细胞，Western b lo t 检测烟曲霉菌孢子刺激液诱导的TREM_1 、TLR_4 和 MyD88蛋白表达；RT-PCR检测分别/ 联合抑制TREM-1 、TLR-4对烟曲霉菌孢子刺 激液诱导的角膜上皮细胞炎症因子分泌的影响。 结果：（1 ) 与对照组相比，真菌性角膜炎患者轻度炎症组、中度炎症组和重度炎 症组中 TREM-1 mRNA的表达均显著升高 ，而且随炎症程度加重，TREM-1表达升高 越明显，各组之间差异有统计学意义 （代0.05) 。动物实验中，真菌感染组8h起角 膜上皮TREM-1 mRNA表达量较空白对照组不断升高 ，48h达到高峰 ，各时间点之间 万方数据 差异具有高度统计学意义(代0.001) ；16h起 ，真菌感染组角膜上皮中TRME-1 mRNA 的表达量均明显高于损伤对照组，差别有统计学意义 （K 0 .0 0 1 );真菌感染组 24h 、 4 8 h 角 膜 上 皮 TREM-1蛋白表达 水平 随时间升高 ，且均明 显高于 空白对照组 (P70.05) ；免疫荧光染色结果发现 ，空白对照组大鼠角膜TREM-1表达主要位于角 膜上皮层 ，真菌感染组大鼠角膜TREM-1表达明显升高 ，主要位于角膜上皮和角膜 基 ；真菌感染组大鼠角膜炎症反应程度与角膜上皮中TREM-1表达水平呈正相关 (r=0.942 ，K0.001) 。（2 ) 烟曲霉菌孢子刺激液刺激体外培养的角膜上皮细胞时， TREM-1表达升高较菌丝刺激液更加明显，两组差异有统计学意义(K0.05