HIV-1整合酶链转移反应抑制剂的荧光筛选方法.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（１）：６７７１ ＨＩＶ１整合酶链转移反应抑制剂的荧光筛选方法 １ １ １ ２ １ １ １ １ 刘　斌 　刘　昕 　李　杉 　何红秋 　张小轶 　谭建军 　陈慰祖 　王存新 （１北京工业大学生命科学与生物工程学院　北京 １００１２４　２重庆市科学技术研究院重庆生物医药与器械研究中心　重庆４０１１２３） 摘要　整合酶被认为是抗ＨＩＶ１药物研究的理想靶点之一。为了建立便捷高效的整合酶链转移 反应抑制剂筛选方法，首先将 ＨＩＶ１整合酶原核表达载体ｐＮＬＩＮ转化入大肠杆菌感受态细胞 ＢＬ２１（ＤＥ３）进行原核表达，并用镍琼脂糖凝胶进行亲和纯化，获得了纯度和活性均较高的整合酶 重组蛋白；然后设计了生物素标记的供体ＤＮＡ和ＦＩＴＣ标记的靶ＤＮＡ，用链霉亲和素磁珠捕获反 应体系中的ＤＮＡ产物；最后用荧光分析仪检测ＤＮＡ产物的荧光信号，并计算待测样品的抑制率。 用已知整合酶抑制剂Ｓ１３６０和ＭＫ０５１８对筛选方法进行了验证，测定结果与已有实验数据相当， 表明本筛选方法能够有效应用于ＨＩＶ１整合酶链转移反应抑制剂的筛选。与现有的整合酶链转 移反应抑制剂筛选方法相比，本筛选方法步骤更为简化、耗时更短、成本更低。 关键词　ＨＩＶ１　整合酶　链转移　抑制剂筛选 中图分类号　Ｑ８１９ 　　整合酶（ｉｎｔｅｇｒａｓｅ，ＩＮ）是ＨＩＶ１生命周期中的关键 　　整合酶发挥其整合功能主要包括３′加工与链转移 酶之一，其主要作用是将 ＨＩＶ１的遗传物质整合入宿 两个反应步骤：将ＨＩＶ１ｃＤＮＡ的３′端切去ＧＴ二核苷， 主细胞的基因组，在 ＨＩＶ１生命周期中发挥着重要作 暴露出ＣＡ末端，即３′加工；将宿主细胞ＤＮＡ切开，并通 用；并且由于人体中没有整合酶的类似物，故整合酶被 过磷酸二酯键把ＨＩＶ１ｃＤＮＡ的３′端与宿主细胞ＤＮＡ ［１３］ ［９１０］ 认为是抗 ＨＩＶ１药物研究的理想靶点 。在逆转录 的５′端连接，即链转移 。目前已有的整合酶抑制剂 酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等传统抗 ＨＩＶ１药物耐药性 主要是通过抑制整合酶的链转移反应活性来发挥作用 ［４５］ ［１１］ 问题日益严重的情况下 ，围绕整合酶等新型靶点的 的 。因此，发展便捷高效的整合酶链转移反应抑制剂 药物研究越来越受到人们的重视。虽然以整合酶为靶 筛选方法对于整合酶抑制剂的研发具有重要的意义。 点的药物研究已有二十多年的历史，但目前仅有一种 　　在前期工作中，利用磁珠捕获 ＤＮＡ技术，建立了 药物——— ［３，６］ 磁珠式高通量筛选方法并应用于整合酶抑制剂的筛 Ｒａｌｔｅｇｒａｖｉｒ（雷特格韦）被ＦＤＡ批准上市 ， 远不能满足治疗艾滋病的迫切需求；并且随着整合酶 选［１２］。针对这一方法步骤繁琐、耗时长、成本较高的缺 抑制剂日益广泛的临床应用，也不可避免地出现了耐 点，本研究在原有筛选方法的基础上对其进行了改进， 药性问题，因此亟需研发新型 ＨＩＶ１整合酶抑制剂来 直接将ＦＩＴＣ荧光基团标记在靶ＤＮＡ上，达到了简化步 ［７８］ 骤、缩短时间、降低成本的目的，可以更好地服务于整 应对艾滋病的治疗 。 　　整合酶由ＨＩＶ１的ｐｏｌ基因编码，全长２８８个氨基 合酶抑制剂的研发。 酸残基组成，分为３个相对独立的结构域———Ｎ端结构 １　材料与方法 域、核心区结构域和Ｃ端结构域。 １．１