SDS-CTAB和高盐沉淀法提取香蕉枯萎病菌基因组DNA的比较研究.PDFVIP

SDS-CTAB 和高盐沉淀法提取香蕉枯萎病菌 * 基因组 DNA 的比较研究 ** 漆艳香 谢艺贤 张欣 张辉强 （中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 儋州 571737 ） 摘要 本研究以香蕉枯萎病菌菌株为试验材料，采用 SDS-CTAB 法和高盐沉淀法提纯 香蕉枯萎病菌基因组 DNA。结果表明：高盐沉淀法是适合于香蕉枯萎病菌基因组 DNA 提取的方法。该方法提取的 DNA OD260/280 值显示产物纯度较高；经琼脂糖凝胶电泳得 到一条带型较宽且清晰的 DNA 谱带，DNA 浓度较高，基本无 DNA 碎带；不用 RNase 处理，已经无 RNA 的干扰，无需任何纯化处理即可以用于 PCR 扩增和 RAPD 分析； 同时对 DNA 提取过程中的细节问题进行了探讨与分析。 关键词 SDS-CTAB 高盐沉淀法 香蕉 枯萎病菌 基因组 DNA 香蕉枯萎病是一种重要的、最具毁灭性的香蕉病害之一，给香蕉种植业造成严重损失。 香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)是植物病害中系统浸染、土壤传播、抗逆 性强、致病性变异较大的病原菌之一，极难防治[1] 。对其分子生物学领域的研究起步较晚， 90 年代初期始见报导，至今文献仍很有限[2,3] ，因而有必要加强香蕉枯萎病菌分子生物学方 面的研究。基因组 DNA 的提取分离，对于在分子水平上研究基因的组成、基因的表达以及 用重组 DNA 技术进行遗传工程的研究是最基础也是最关键的一步。香蕉枯萎病菌属于多细 胞真核生物，需在固体或液体培养基上培养才能获得提取 DNA 所使用的菌丝体，培养基均 含有糖、琼脂等营养物质，这就使真菌细胞 内富含多糖、蛋白质等杂质，给 DNA 的提取带 来一定的困难。 目前国内已有许多文献报道提取真菌核酸 的方法[4,5] ，但均未见有具体报导 香蕉枯萎病菌基因组 DNA 的提取方法。 本研究拟采用大多数学者提取真菌基因组 DNA 的所用的方法：SDS-CTAB 法[6]和高盐 沉淀法[7,8]进行香蕉枯萎病菌基因组 DNA 的提取实验，旨在寻找一种快速、操作简便 的从香 蕉枯萎病菌菌丝体中提取高质量、高分子量 DNA 的方法，为今后进一步开展香蕉枯萎病菌 的分子生物学研究奠定基础。 1 材料与方法 1.1 供试菌株 在海南省香蕉种植区采集的 10 个香蕉枯萎病菌菌株，编号分别为 a、b、c、d、e、f 、 g、h、i、j 。10 菌株经单孢分离后作为试验材料。 1.2 香蕉枯萎病菌菌丝体的培养 将分离好的单孢菌株接种于 PDA 平板上，置 25 ℃恒温箱中培养约 1 周。将菌落打 成 7 mm 的菌块，接到 PDA 培养液中，25 ℃黑暗振荡培养 7 d，过滤获得菌丝体，用蒸馏 水冲洗干净营养液后，吸干水分，加液氮将菌丝体研磨成干粉，于-20 ℃冰箱中保存备用。 1.3 基因组 DNA 的提取方法 1.3.1 SDS-CTAB 法 1、 取 25 mg 菌丝干粉于 1.5 ml 灭菌离心管 中，加 500 µl 提取缓冲液（5 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 mM NaCl; 100 mM EDTA ）悬浮干粉，在涡流振荡器上混匀； 2、加入 50 µl 10 %SDS 和 2 µl 20 mg/ml 的蛋白酶 K，37 ℃温育 1 h； 3、加入 75 µl 5 M NaCl 和 65 µl CTAB/NaCl （10 % CTAB /0.7 M NaCl）溶液，65 ℃温育 20 min ； 4 、用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25:24:1)抽提 1 次，10000 g 离心 10 min； 5、取上清液，再加等体积的氯仿∶异戊醇 （24:1 ），10000 g 离心 10 min，取上清液； 6、用 0.6 倍体