反转座子L1在肿瘤中的初步功能探究.pdf

中文摘要 中文摘要 随着功能基因组的研究深入，过去曾被称为“垃圾DNA(juIll【DNA)”已显 示出非常重要的调控作用。其中在基因组中广泛分布，在人类基因组中有10万 elemellt 1，LINE．1)正被越来越多的研究所关注。L1是一种长散布重复元件，其绝大多 数是以一种5’截短的形式存在，具有全长的功能性序列仅为50．100个拷贝，该序 列在基因组中能自主性转座，被形容为基因组中的“舞蹈者”， 其反转座是通过 TPRT(target-primed 通过表观遗传学调控(启动子的高度甲基化)维持其沉默状态，但生殖细胞发育、 胚胎发育的早期以及肿瘤细胞中则为激活状态。近来的研究表明在几乎所有的肿 瘤细胞中L1均为激活状态，其表达与转座活性与肿瘤的发生、发展有着非常密切 的关系。所以通过L1的研究对了解肿瘤发生、发展和调控的分子机理以及肿瘤药 物靶标具有重要意义。 研究表明在肿瘤细胞中，L1均出现不同程度的低甲基化，其激活将引发反转 座发生。为了验证L1在多种肿瘤细胞中的甲基化状态的改变，我们采用甲基化敏 感与非敏感的同裂限制性内切酶结合PCI扩增方法进行检测。在此过程中首先用 甲基化敏感的限制性内切酶分别对不同来源的DNA进行处理，随后对位于L1启 动子中酶切位点区域的上游与下游分别设计PCR引物，进行PCR扩增，如能扩增 出设计大小的片段，则表明该区域没有被甲基化敏感的限制性内切酶所切开(该 位点出现甲基化)，反之不能被扩增，则表明该区域被甲基化敏感的限制性内切 酶所切开(该位点没有出现甲基化)。实验中我们选择了同裂酶MSPI和HpaII(两 种酶的识别与作用序列为5’．CCGG．3’)对三种常见肿瘤细胞DNA进行酶切实验， DNA中部分 并用正常血DNA作对照，验证其甲基化状态。结果发现在H印G2 中则HpaII酶切与没有酶切的条带没有差别，MSPI酶切后电泳条带减弱不明显， H23两酶切后无明显差异，为分析其原因，对其序列测序比对表明：启动子区变 异较大，多集中在CpG区域。 在对Ll编码蛋白的研究中，发现其编码蛋白ORF．1p远远过量于ORF．2p，而 且OI讧．1p被发现与所有的己知蛋白均没有同源性，其具体功能目前尚不十分清 Ol讧l的RNAi表达载体， 楚。为此，我们使用I州Ai技术成功构建了两条针对Ll 通过RT．PCR以及Westemblot检测，实验结果表明：在多种肿瘤细胞中，两种RNAi 中文摘要 表达载体均能明显降低L1的表达水平。 为研究L1ORFl在肿瘤细胞中的功能，我们将上述载体转染肿瘤细胞。结果 0盯1的 显示，通过绘制细胞生长曲线(MTT-aussav测定细胞生长速度)，降低L1 表达水平，能够显著抑制肺癌细胞系A549，肝癌细胞系H印G2以及乳腺癌细胞系 MCF一7的生长。这表明，在多种肿瘤细胞中，L1ORFl可能发挥促进细胞生长的 作用。 同时，肿瘤细胞转移和侵袭的基础是锚定非依赖性生长能力。我们使用L1 RNAi表达载体降低了L1OI疆1的表达水平，软琼脂锚定的克隆形成实验结果发 现，肺癌细胞系A549，肝癌细胞系HepG2以及乳腺癌细胞系MCF．7的锚定非依赖 性生长能力显著下降，集落变小，数量减少。这表明，在多种肿瘤细胞中，L1ORFl 可能与锚定非依赖性生长有关，进而有可能参与调节肿瘤细胞迁移和侵袭过程。 此外，将两种L1I斟灿表达载体分别转染上述三种常见肿瘤细胞系后，细胞 周期检测(流式细胞技术)的结果显示：肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF．7和 肝癌细胞H印G2等的细胞周期运转均明显阻滞，A549及乳腺癌细胞系MCF．7的细 胞系阻滞在S／G2，肝癌细胞系HepG2的细胞系阻滞在G2／M。这表明，在多种常 见肿瘤细胞中，L10RFl可能在细胞周期运转的过程中发挥重要作用，促使肿瘤 细胞系通过多个时相的监测点。