大鼠肌卫星细胞体外培养和移植延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究.pdfVIP

中文摘要 目的：探索大鼠肌卫星细胞体外培养的技术方法，并观察其体外增殖、分化 的特征。将体外培养的肌卫星细胞移植至失神经支配的骨骼肌，观察其体内存活， 分化，及形成肌管的过程，并评判肌卫星细胞移植对于延缓失神经骨骼肌萎缩的 作用。 方法： 第一部分：大鼠肌卫星细胞的体外培养与鉴定 以成年Wistar大鼠后肢肌为取材组织，采用I型胶原酶和胰蛋白酶，以“两 步法”消化分离肌卫星细胞，并采用差速贴壁法纯化。培养肌卫星细胞的增殖培 养基采用Ham、S F10+20％FBS+5ng／m1bFGF，分化培养基采用Ham、S FlO+2％FBS+2％HS。观察体外培养的肌卫星细胞增殖、分化及融合形成肌管的状态。 采用免疫荧光技术，对静止和激活的肌卫星细胞分别选择其特征性标志物 志，分别进行细胞鉴定。 第二部分：肌卫星细胞移植与体内分化的观察 体外培养的肌卫星细胞经纯度鉴定之后，以带e—GFP基因的腺病毒转染示 踪，并移植至失去胫神经支配之腓肠肌。分别在移植之后1周、2周、4周取材 腓肠肌组织，制作连续冰冻切片。荧光显微镜下观察，带GFP绿色荧光的移植细 胞存活、分化及形成肌管的状态。 第三部分：肌卫星细胞移植延缓失神经肌萎的疗效观察 选取成年Wistar大鼠24只，于右后肢切断胫神经，建立失神经肌萎模型。 将其随机分为两组，其中12只Wistar大鼠于右侧腓肠肌注射肌卫星细胞悬液(移 植组)，另外12只仅注射细胞培养液(对照组)。 移植4周后，选取移植组与对照组各6只大鼠，取材双侧腓肠肌，称肌湿重 后，制作石蜡切片，行HE染色与Masson染色，比较肌纤维平均截面积与胶原纤 维增生状态。剩余大鼠取材右侧腓肠肌，制作冰冻切片，行ATP酶组织化学染色， 比较移植组和对照组肌组织中ATP酶的含量。 结果：采用I型胶原酶和胰蛋白酶联合消化，并用差速贴壁法纯化的方法， 可在体外获得高纯度的大鼠肌卫星细胞。体外培养的大鼠肌卫星细胞可在合适条 件下分化，并相互融合形成肌管。培养所得细胞在分化前表达静止期肌卫星细胞 特征性标志物Pax7，在激活后表达MyoD，在分化后表达肌细胞特有骨架蛋白 Desmin(结蛋白)和a—SCA(Q横纹肌肌动蛋白)。 外源性肌卫星细胞移植后，可在肌组织内存活、分化、相互融合形成肌管。 肌卫星细胞移植组的腓肠肌，在肌湿重、肌纤维平均截面积、胶原纤维增生及 ATP酶改变各方面，均较对照组有改善，其差异具有统计学意义。 结论：通过分离消化大鼠肌组织，可在体外获得高纯度的具有成肌能力的肌 卫星细胞。将肌卫星细胞移植于失神经支配的骨骼肌，能够发挥延缓肌肉萎缩的 作用。 关键词：肌卫星细胞，细胞培养，细胞移植，肌肉萎缩，失神经骨骼肌 中图分类号：R745，R746 Abstract cells ratsatellite ofculturing thetechniques explore objective：To V1tro· 1n differentiatlon and theiriferation observeprol to jnvitro，and of o士tne