12《仪器分析》高效液相色谱法(3课时).doc

章节名 称 第三篇、色谱分离技术 授 课安 排 授 课 时 数 3 授 课时 间 授 课 方 法 讲授 授 课 教 具 教 学目 的 1、了解高效液相色谱法特点 2、了解高效液相色谱仪 教 学重 点 高效液相色谱法特点 教 学 难 点 高效液相色谱仪 项目十九 现代高效液相色谱仪的认知 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪70年代初发展起来的一种新型分离分析技术。在常压下操作的液相色谱，分离一个样品往往长达几小时至几十小时，因此工作效率很低。人们曾对这种经典液相色谱法试用了柱前加压或柱后减压的办法来提高流速，以缩短分离时间，但是结果失败了。根据液相色谱理论，因为随着流动相流速的提高，板高则增大，所以柱效会显着降低。随着生产技术的提高，人们制成了细小（<10μm）而高效的填充物，从而使柱效大大提高。但是随着填充物粒度的减小，柱压降显着增大，为了得到合理的流速，使用了高压；输液泵，使流速达到110 mL/min。从而使分析一个多组分样品只需几分钟到几十分钟时间。随着高效固定相、高压泵和高灵敏度检测器以及电子技术和计算机技术的应用，70年代以逐步实现了液相色谱分析的高效、高速、高灵敏和自动化操作。因此人们常称它为高效液相色谱或现代液相色谱，以区别于经典液相色谱。气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。 图12－10 高效液相色谱流程示意图 （一）高压输液系统高压输液系统g。对温度和流量不敏感，可用于梯度洗脱，几乎所有的高效液相色谱都配有紫外光度检测器。图12－11是一种双光路结构的紫外光度检测器光路图。 图12－11紫外光度检测器光路图 S—低压汞灯，F1,F2—滤光片，L1,L2,L3,L4—透镜 C1—测量池，C2—参比池，D1,D2—光电管 2．示差折光检测器（RI）依据不同性质的溶液对光具有不同的折射率，通过连续测量溶液折射率的变化，便可知各组分的含量。溶液的折射率等于纯溶剂（流动相）和溶质（试样组分）的折射率乘以各自的质量分数之和。示差折光检测器为通用型检测器，凡与流动相折射率不同的组分均可进行检测，且操作简便。但这种检测器灵敏度较低，对温度敏感，不能作梯度洗脱。 3．荧光检测器 根据某些物质受激后能产生一定强度荧光的性质，可制成灵敏度极高的荧光检测器。它的最小检出量可达，由于不同物质的激发波长不同,受激后所产生的荧光波长各异,因此荧光检测器具有很高的选择性。它适合于稠环芳烃、甾族化合物、酶、氨基酸、维生素、色素、蛋白质等荧光物质的测定。 4．电化学检测器 电化学检测器是一薄层电解池。具有电化学氧化还原性质的化合物流进检测器即发生电解，产生的电流经放大而被检测。它适用于有电活性的硝基、氨基等还原基团的有机化合物的检测。检出限达皮克数量级。 三、高效液相色谱的类型 根据固定相和分离机理的不同，高效液相色谱可以分为以下几类。 （一）液－固吸附色谱 液－固吸附色谱是基于各组分在固体吸附剂表面上具有不同吸附能力而进行分离。当流动相通过吸附剂时，吸附剂表面的活性中心’－氧二丙腈、聚乙二醇、角鲨烷等。 液一液色谱流动相尽可能不与固定液互溶，两者的极性差别应很大。固定液为极性、流动相为非极性的液一液色谱称为正相色谱，反之称为反相色谱。前者主要用来分离极性化合物，被分离组分按极性从小到大的顺序流出色谱柱；后者主要用来分离非极性化合物，被分离组分流出顺序与前者正好相反。液一液色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。但由于固定液易流失，使色谱柱的保留行为发生改变，并引起分离试样的污染，因此已基本上被化学键合固定相所取代。 （三）化学键合相色谱 化学键合相色谱是通过共价键将有机固定液结合到硅胶载体表面，而得到各种性能的固定相，特别是非极性键合相材料的商品化，极大地促进了“反相”高效液相色谱的发展。键合相的烷基链长和键含量是影响固定相试样容量、溶质k值、柱效能和分离选择性等色谱性能的重要因素。目前应用最多的是十八烷基键合硅胶(Oc