生物技术之植物转基因.pptVIP

第六节 植物遗传转化体系 一、植物遗传转化载体系统 二、植物遗传转化方法及原理 三、转化子的鉴定与遗传分析 一、植物转化载体系统 质粒载体系统 病毒载体系统 无筛选标记载体系统 植物转基因载体--启动子 诱导型启动子 无选择标记转化系统 重组：Cre/Lop、R/RS系统 借助于转座子：Ac/Ds 共转化 选择标记基因的组织特异性表达 二、植物遗传转化的方法 植物遗传转化技术可分为两大类： 生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。 直接基因转移技术 包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。 1、农杆菌介导的植物遗传转化体系 Agrobacterium Mediated Transformation 农杆菌致病－冠瘿瘤 农杆菌生物学特性 农杆菌介导的转化是目前唯一被人类所认识的生物界之间自发交换遗传物质的天然转化体系。 农杆菌将其Ti质粒上的T－DNA和一些毒性蛋白（Vir proteins）转入寄主植物细胞，在Vir蛋白和寄主植物蛋白辅助下，T－DNA整合在寄主植物染色体上，并最终在寄主植物中表达T－DNA上的基因。 Ti 质粒特性 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的双链环状DNA分子，含200～800Kb，具有五个主要功能区域： ①. T-DNA：（transferred DNA） LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； ②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区； ④. 复制原点（original replication region，Ori） ； ⑤. 毒性区（virulence region，Vir） 其中Vir区和T-DNA区与冠瘿瘤的生成有关，结合转移区是细菌吸收和利用冠瘿碱的区域。 T-DNA T-DNA可以将其间携带的基因整合到植物基因组中，但这些基因本身与T-DNA的转移和整合无关，仅仅T-DNA左右两端边界各有一个25bp的正反重复序列是其加工所必须的。 左右两边界之间对序列可以被其它序列替换，如目的基因。 Vir 区 Vir区大小：约30kb大小； Vir区：包括A－J等10个操纵子（operator），由24个基因起共调控（co-regulation）作用， Vir蛋白对作用： Vir区基因需要在植物细胞释放的信号因子激活下才能表达，其编码蛋白决定了T-DNA的加工和转移。 部分Vir蛋白在农杆菌中和在植物中的功能 农杆菌介导的植物转化机理 农杆菌与植物互作的过程 (1)农杆菌识别并附着在植物细胞上，这一过程主要由农杆菌染色体基因编码蛋白和寄主受体蛋白介导的； (2) 农杆菌VirA–VirG双组分信号传导系统感知植物的特殊信号，如乙酰丁香酮等酚类物质及多糖类化合物； (3) VirG介导的信号传导和其它Vir基因的活化； (4) T-DNA加工，产生可转移的T－DNA链，即T－链； (5) VirB–VirD4转运复合体形成，T－链和一些Vir蛋白被运送到植物细胞；（图） (6) 形成成熟的T－复合体；（图） (7) 寄主植物蛋白（如AtKAPα、VIP1 和Ran等）协助将T－复合体运送至植物细胞核； （图） (8) T－复合体在核内转运至寄主染色体组，在农杆菌VirD2 和/或 VirE2蛋白，以及植物某些因子协助下，T-DNA整合进入植物基因组。 农杆菌与植物互作分子基础 农杆菌对植物吸附 农杆菌要实现对植物的转化，首先要附着在植物细胞表面，其过程是：单个细菌以极性方式，在细胞表面乙酰化酸性荚膜多糖介导下附着在植物细胞表面；在植物创伤细胞分泌物诱导下，细菌产生大量的纤维素和一些糖类化合物，将细胞包囊起来，最后在植物细胞表面形成一个囊状结构。 细菌基因起主要作用，其中至少有5个染色体基因产物参与此过程，它们是：attR、chvA、chvB、psvA(exoC)和cel。ChvA和ChvB基因编码蛋白与环β-1, 2-D-葡聚糖合成有关，控制多糖的合成；ce l基因与纤维素合成有关，编码产物为β-脂键多糖，形成纤维细丝，参与附着过程中细菌表面的成囊过程；Att基因编码产物是细胞膜外蛋白和外周蛋白，参与了细菌的附着；psvA(exoC)同chvA和chvB相似，与合成环β-1，2-D-葡聚糖有关，且还能影响琥珀酸聚糖的形成；ChvD编码一种细菌ATP结合蛋白，在低pH值和磷酸饥饿的情况下可诱导VirG蛋白保持一定的表达水平。以上基因除attR基因参与接触外，其余基因编码蛋白及其参与合成的产物都可能参与了成囊过程。 宿主植物细胞的受体对农杆菌吸附具有一定影响作用，但目前对此了解甚