蛋白磷酸化检测技术的建立和其在肝细胞肝癌中的应用研究.pdfVIP

蛋白磷酸化检测技术的建立及其在肝细胞肝癌中 的应用研究 博士研究生： 孙德光 指导教师： 王立明教授 专业名称： 外科学 摘 要 肝细胞肝癌(hepatocellular 预后极差的恶性肿瘤之一。我国由于肝炎和肝炎转肝硬化的病人众多， 致使肝癌在我国的发病率和病死率均高于世界平均水平，全世界50％以 上的肝癌发生在我国，每年约有23万人死于肝癌，位列我国癌症病死率 的第二位，占我国全部恶性肿瘤死亡人数的l8．8％。目前肝癌发生发展 及转移复发的精确分子机制尚不完全清楚。临床主要依靠定期复查AFP 和B超来检测肝癌和术后转移复发情况，但在中国AFP阳性的肝癌只有 70—80％，而B超难以发现小于lcm的肝癌组织，诊断均存在旨区，不能 准确及时地进行预测。因此探讨肝癌发生发展及转移复发的相关凶素及 分予机理，揭示其发生发展及转移复发的精确分子机制、寻找早期诊断 肝癌、预测转移的生物标记物和干预治疗的靶分子，对进一步提高我国 肝癌的治疗水平具有重要意义。 蛋白质组已经成为系统生物学时代最热点的研究领域之一。蛋白质 组学技术也随之不断发展完善，并与各个学科交叉而产生新技术、新方 法。这些蛋白质组学的新技术工F逐渐成为现代生物医学研究新的强有力 工具。肿瘤的基础研究随之也进入了一个全新的领域。但蛋白的功能仅 仅从量的变化上分析往往会限制我们的研究视野，很多蘑要蛋白质的活 性是由翻译后修饰调节的，甚至有时蛋白水平上看不到明显变化但翻译 后修饰水平己发生显著变化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内最．重要的 共价修饰方式之一，参与调节细胞的多种生命活动过程，包括细胞的增 殖、发育和分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新 陈代谢、肿瘤发生等。鉴于蛋白质磷酸化修饰在生命活动中所具有的蓬 要意义，解密蛋白质磷酸化修饰过程的奥秘以及进一步理解蛋白质磷酸 化介导的生物学功能成为了众多生物学家所关心的主题。并且研究不同 生理条件下的生物体蛋白质磷睃化修饰的状态，能够更清晰地认{；}{q!物 体信号通路的变化，继而揭示疾病产生的机理。但由于生物体内磷酸化 蛋白质的含量及磷酸化位点的化学计量值常常很低，大规模分析磷酸化 蛋白质在技术上还很具有挑战性。所以磷酸化蛋白质组学的研究发展缓 慢，与肝癌相关磷酸化修饰谱的规模化分析鉴定在国内外更是鲜为报道。 课题组在前期工作中研发出许多磷酸化蛋白质检测的创新技术，将这些 磷酸化蛋白质检测技术用于临床疾病一一肝细胞肝癌研究中，有利于揭 示肝癌的发病机制，寻找肝癌诊断和治疗的靶点。 目的：1．首先全面、系统的考察Ti4+．IMAC对磷酸肽富集的选择性 和特异性。2．利用Ti4+．IMAC富集实际样本人肝癌组织及J下常肝组织酶 解后的磷酸肽，结合LC．MS2．MS3检测和数据自动检索等一系列蛋白磷 酸化检测技术规模化筛选人肝癌组织和正常肝组织中磷酸化蛋白质表达 谱，寻找可能参与肝癌发生发展的磷酸化蛋白质。3．探讨入肝细胞肝癌 5、XIAP、P27．T1 组织中差异磷酸化蛋白(PED／PEA．1 87)的表达情况及 其与肝细胞肝癌临床病理特征的关系。 为样品，利用MALDI-TOF MS质谱对比分析Ti4+．IMAC富集磷酸肽效 果。2．收集l2例肝细胞肝癌和l 0例人正常肝组织，提取总蛋白，经胰 蛋白酶酶解后，利用Ti4+-IMAC富集实际样本人肝癌组织及正常肝组织 酶解后的磷酸肽，结合LC．MS2．MS3检测和数据自动检索等一系列蛋白 磷酸化检测技术规模化筛选人肝癌组织和正常肝组织中磷酸化蛋白质 谱，结合生物信息方法预测蛋白的磷酸化位点及蛋白激酶等信息，寻找 可能参与肝癌发生发展的差异磷酸化蛋白。3．挑选其中三种差异磷酸化 蛋白，通过免疫组织化学、Western blot及RT-PCR分子生物学方法，观 察其在40例癌组织及对应癌旁组织和1