铜蓝蛋白的分离纯化及其性质及功能基团的分析研究.pdfVIP

褚渡．铜蓝蛋白分离纯化及其性质与功能基团研究 铜蓝蛋白的分离纯化 及其性质与功能基团研究 生物化学与分子生物学专业硕士研究生褚波 指导教师 唐云明教授 摘 要 铜蓝蛋白(EC1．16．3．i)是一种存在于脊椎动物血清中并携带了95％以上血清铜的a。糖 蛋白唾液酸酶，主要在肝脏中合成。该蛋白是～种应急反应蛋白，当生物体发生感染、炎症 或损伤时，诱发了肝脏内铜蓝蛋白基因的大量表达使血清铜蓝蛋白浓度升高。铜蓝蛋白在血 浆中的含量大概为300u∥mL，拥有多种生理功能，比如铜离子运输，血液凝固．血管生成， 铁平衡，铁转运以及抗氧化作用等。目前经研究证明与铜蓝蛋白有关的疾病有老年痴呆、糖 尿病、视网膜变性，锥体外系症状、wilson症、心血管疾病、神经退化、动脉粥样硬化等疾 病。研究铜蓝蛋白与这些疾病之间的关系已经是医学和生物学界的热点之一。 猪为哺乳纲，偶蹄目，猪科的动物，猪是人类重要的肉类来源，对人类的生活、经济 作出了巨大的贡献。对猪血来源的铜蓝蛋白进行研究一方面可以弥补我国在铜蓝蛋白相关研 究方面的空白，为研究铜蓝蛋白的生理功能研究提供一定的理论基础；另～方面，可以让广 大农民朋友认识到猪血的价值，让猪血的利用价值得到更大程度的开发．提高其经济价值。 此外，由于铜蓝蛋白参与了众多生理功能，因此它还是一种潜在的蛋白药物，也许可以提高 动物的抗病能力，促进动物生长等。 本文主要对铜蓝蛋白的分离纯化、理化性质、酶促动力学性质、抑制剂以及功能基团进 行了研究，结果如下： 1．铜蓝蛋白的分离纯化 以猪血清为原材料，经稀释、正丁醇脱脂、超滤、硫酸铵分级沉淀获得粗酶液，进～步 经过DEAE一琼脂糖离子交换柱层析，羟基磷灰石层析，Superdex一200凝胶过滤纯化，以 sDs—PAGE和等电聚焦电泳检测其纯度，获得了电泳纯的铜蓝蛋白，提纯倍数为216倍，比 措波．铜蓝蛋白夯离纯化及其性质与功能基团研究 活性为l_08u／mg，回收率为32％，丸。。／A。。为O．08。 2．铜蓝蛋白的性质研究 理化性质研究表明，铜蓝蛋白分子量约为130KD，为单亚基蛋白，其等电点为435。总 糖含量为7．8％，对蛋白酶有一定的抵抗能力。酶促动力学研究表明，铜蓝蛋白的晟适pH 值为5，在pH4一lO．5的范围内都比较稳定；最适温度为60℃，温度高于55℃不稳定；反应 3．金属离子中对钎可蓝蛋白抑制能力晟强的为Fe”，而zn“，Ba“，Cu’，Mn”对铜监蛋 白活性也有较强的抑制作用，Mg”、Pb”对其活性则仅有较弱的抑制作用；化学试荆中，叠氩 钠，抗坏血酸，草酸的抑制作用虽强，其次是双氧水，柠檬酸，cl一和EDTA，而尿素对铜蓝 蛋白活性基本无抑制作用。 4．铜蓝蛋白功能基团的研究． 表明PMSF、NBS、TNBS、DTT以及乙二醛对铜蓝蛋白氧化酶活性有较强的抑制作用，而IAc 对铜蓝蛋白的胺氧化酶活性基本无影响，wSC、PcMB则有比较弱的激活作用；对铜蓝蛋白soD s0D活性基本无影响。 关键词：铜蓝蛋白分离纯化性质功能基团 褚波，铜蓝蛋白分离纯化及其性质与功能基团研究 andmodincationof of Purification，properties groups f|om ceruloplasminpigs and MoIecuIar Discipline：BiochemistryBioIogy and Direction：EnzymologyEnzym