BRL-37344对豚鼠心肌细胞ICa-L,Ito的影响.docVIP

BRL-37,344对豚鼠心肌细胞ICa－L，Ito的影响 修芸1，孔祥如2，吴兰香1 1重庆医科大学生命科学研究院（400016）; 2重庆医科大学附属儿童医院（400014） 摘要： 目的 为研究β3肾上腺素能受体β3肾上腺素能受体激活后心肌细胞电生理活动的变化采用全细胞膜片钳技术记录豚鼠心肌细胞应用β3肾上腺素能受体激动剂4-[-[2-hydroxy-(3-chlorophenyl)ethyl-amino]propyl]phenoxyacetate（BRL-37,344; BRL）前后IcaL，Ito的变化 关键词： β3肾上腺素能受体; 瞬时外向钾电流 ; L型钙通道; 膜片钳 β肾上腺素能受体广泛存在于心血管系统中，调控心血管的生物学效应[1]。1989年首次在脂肪组织发现了肾上腺素能受体的新亚型--β3AR, 该受体在心脏组织也有表达并广泛调控离子通道，对高血压，心衰等疾病的发生发展起重要作用[2，7，8]。近年来对 β3AR介导的离子通道研究越来越多[3-6，9]，包括ICa-L，IKs等，又以对ICa-L的研究居多，但研究结果不一：有研究表明，BRL37344可介导负性肌力作用且该作用与L型钙离子通道功能下调有关[3]在心衰的大鼠中BRL37344降低L型钙离子电流的作用更明显，但是2008年v.Arvydas Skeberdis等[4]以人心房组织作为研究材料时，发现BRL37344能增强Ica-L电流并且可增加心肌收缩力。那么BRL37344对Ica-L的作用到底是增强还是抑制，是本研究探讨的一个方向。同时β3AR对瞬时外向钾电流和钠电流的调控研究较少，BRL37344作为β3AR的特异性激动剂被广泛的应用于对β3AR的各种研究中，本文选用BRL37344干预，研究β3AR对豚鼠心肌细胞ICa-L，Ito的影响。 1 材料与方法 实验动物 豚鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供 ,1-3天龄乳鼠,雌雄均可. 试剂 基础培养基：DMEM粉末10g,NaHCO33.7g,加去离子水至1000ml溶解，调PH至7.2-7.4,0.22微米孔径滤膜过滤除菌，临用前每80ml加入新生小牛血清20ml、青霉素100单位/ml、链霉素100μg/ml。电极外液（Tyrode氏液）（mmol/ml）：NaCl 136.9 、KCl 5.4、 MgCl2 0.5、 NaH2PO4 0.33、 HEPES 5.0 、Glucose 10.0、 CaCl2 1.8，用NaOH调节PH至7.4。Ito电极内液（mmol/ml）：KCl 110、MgCl2 1、K2ATP 5、HEPES 10，用KOH调PH至7.2，最终胞内液钾离子浓度接近145 mmol/ml。Ica-L电极内液（mmol/ml）：CSCl 130、MgCl2 2、EGTA15 、MgATP3、 HEPES 10、Glucose 10，以CSOH调PH至7.2。 BRL37344， II型胶原酶，胶原酶P，HEPES及glucose购自Sigma公司，DMEM培养基购自GIBCO公司，其余产品为国产分析纯。 心肌组织块原代培养 乳鼠断颈处死后，迅速取出心脏，以D-Hanks液漂洗去除血污，并剥除脂肪血管等部分，用D.Hanks液漂洗心肌组织2次，随后将心肌组织剪成1 mm 左右的小块，放人D.Hanks液的试管中，吸管吹打待组织沉淀后吸出上清液，重复3次尽量去除红细胞，然后直接把心肌组织块放人直径35 mm培养皿中贴牢，开始时加极少量培养基以免细胞块漂浮，放人37oC、5％ CO2孵箱。15-20分钟后小心加入少量培养基，孵箱中绝对静置培养24 h，24 h后补加2 ml培养基，以后每2天更换培养基。操作时动作尽量要轻以防组织块脱落。 膜片钳全细胞记录 用0.25%的胰蛋白酶和含少量PVP的II型胶原酶将组织块中爬出的细胞进行消化，在倒置显微镜下观察，细胞回缩即终止消化，将消化下的细胞离心（1000转/分）5分钟，弃上清并将得到的细胞团块重新悬于台式液中，选取镜下边缘整齐，表面光滑的细胞进行实验。电极入液后电阻在2-5MΩ间,三维控制电极缓慢移向镜下细胞,当电极接触到细胞,软件上电阻值增大几个MΩ后,停止移动微操,通过负压系统给出适当的负压使封接达到GΩ后,让细胞恢复几分钟,此时细胞有的会自行破膜,若未破则给与负压破膜,若封接电阻值仍然在GΩ或几百Ω,则全细胞记录模式形成,此时可运行事先设计好的PROTOCOL记录Ica-L，Ito 。 数据处理 实验结果以Pulse软件 、IGOR软件、ORIGIN软件等处理，Ito离子流的大小以钳制电压下的电流峰值与膜电容的比值表示，Ica-L直接以原始电流的峰值来表示，计量资料以mean±SEM表示，两组