Slo3通道对小鼠精子Ca2%2b信号作用的的分析研究.pdfVIP

摘要 lHlPliilHEF／IIIIIIIIllIIf 摘要 研究背景和目的：不育不孕症是影响人类繁衍和心理健康的一种重要临床 疾病，其中约有一半的病因在于男性。精子是男性生育最重要的因素之一，由 睾丸生成，它逐渐成熟后贮存在附睾内，但此时的精子是不具有授精能力。精 子进入雌性生殖道后，随着理化环境(pH值、渗透压和化学成份等)的改变， 会经历获能、超活化和顶体反应等生理过程，最终完成授精。这些生理过程是 精子功能必不可少的部分，对精子完成授精至关重要。 与在其它细胞相似，Ca2+作为精子细胞的第二信使扮演着重要的角色，其直 接或者间接调控精子获能、超活化和顶体反应等重要生理过程。Ca2+通过精子细 胞膜上的Ca2+通道流入细胞中。目前利用电生理技术在小鼠精子上检测到电流 电流。已经有研究表明小鼠精子上最主要的K+离子通道——S103在精子的获能 过程中具有重要作用。随着精子胞内碱化，精子膜上的pH依赖的S103通道随 之开放，导致细胞膜电位超极化。膜电位超极化可能通过两方面影响精子Ca2+ 信号：一方面增加ca2+内流的驱动力使Caz+内流增多；另一方面降低电压依赖 趁重要调茧：但其单独对的Ca2+信号作用尚不明确。在诸多的Slol通道特异的 以及广泛的K+通道阻断剂中，如CTX、IbTX、TEA、4一AP以及奎尼丁等，只 有奎尼丁能强效抑制S103通道。 另外活性氧物质(Reactive oxygenspecies，ROS)对小鼠精子功能也具有影 响作用。虽然适量的ROS与精子正常生理功能密切相关，但是ROS过量时会引 起细胞氧化一抗氧化失衡，对精子造成严重的损伤，降低精子活性、抑制顶体反 应、严重影响精子的授精能力。ROS对精子造成的损伤与S103壬精子的表型非常 似，基于这些相似性我们推断ROS可能通过作用于S103通道而对精子胞内Ca2+ 信号有影响作用。通过本课题的研究希望探索到男性不育与S103通道的相关病 因，以及为开发新型、安全、有效的男性避孕药提供理论依据。 方法：一、利用荧光共聚焦Caz+成像技术，对三个月以上的雄鼠精子处理 后进行实验；对细胞进行以下处理：空白对照组(Ctrl)、奎尼丁处理组(Ctrl+Qui)、 II 摘要 过氧化氢(H202)处理组，随机选取三个月以上的雄性小鼠。实验内容：1、取 小鼠附睾尾部分装在离心管中离心；2、将离心后的精子分置在已经涂有Cell—Tak 和Poly—L．1ysinehydrobromide等试剂的容器中，并使细胞充分贴壁；3、在精子 充分贴壁的容器中加入Fluo．4AM染料，在保证室温、避光等实验条件下使细胞 染色30分钟；4、将黏贴有精子的容器充分清洗后，在60倍油镜下观察精子给 nm。 药后的荧光变化，激发光波长488am，接收波长535—565 二、利用膜片钳技术：在全细胞模式下充分研究奎尼丁对KSper的抑制， 预期找到奎尼丁阻断精子本身K+电流的剂量一效应关系。 结果：1、奎尼丁会使精子细胞ca2+信号降低，并且这种降低作用与奎尼丁 浓度呈正相关，即随着奎尼丁浓度的增加，其对精子Ca’2+信号的抑制作用也增 加。奎尼丁实验浓度分别为O．1uM、1 后观察到精子细胞Ca2+信号都下降，0．1“M浓度的奎尼丁可以引起精子内Cap 信号降低约16％；1uM浓度的奎尼丁可以引起精子内Ca+信号发生大约28％的 下降；10¨M浓度的奎尼丁就可以引起精子内Ca2+信号发生更大的变化，大约 降低45％；而100 gM及1000laM浓度的奎尼丁引起精子细胞Ca2+信号降低的 幅度更大，分别约73％和90％。信号下降一般的药物浓度(IC50)大约是11F,M。 有趣的是奎尼丁抑制KSper的IC50大约是10“M。 2、我们初步的数据表明H202也影响精子Ca2+信号。但与奎尼丁不同的是， 过氧化氢在低浓度时表现出对精子Ca2+信号的促进作用；在高浓度时则表现出 较大的抑制作用。过氧