靶向siRNA体外抑制肝癌HepG-2细胞VEGF-B基因表达的探究.pdfVIP

中文摘要 i 靶向S 摘 要 目的：原发性肝癌(简称肝癌)是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一， 手术切除是目前治疗肝癌首选和最有效的方法。但肝癌患者临床症状出现 较晚，症状出现后大多数患者已处于中晚期，手术切除率低，预后差。术 后肿瘤的转移和复发是影响患者长期生存的首要原因。肿瘤的生长及转移 endothelial 需要新生血管的生成，血管内皮生长因子家族(vascular growth factor family venom VEGF)、VEGF．F(又称snake growth placenta 均由哺乳动物基因编码。VEGF家族在脊椎动物中存在广泛的表达，在不 同的物种中其编码序列高度保守。VEGF家族成员及其受体在众多肿瘤组 织尤其是实体肿瘤组织(如肝癌)中存在异常表达，并与肿瘤的侵袭、转 移、复发等生物学特性密切相关。VEGF．B是VEGF家族成员之一，在各 种不同的肿瘤组织中存在异常表达，在肿瘤的侵袭、转移方面起着重要的 作用。我们的前期研究显示：VEGF．B在肝癌的生长、侵袭及转移中起重 要作用，并与肝癌患者的预后密切相关。因此，抑制VEGF．B基因的表 达可望抑制肝癌细胞的增殖、转移。RNA干扰(RNA 是近些年发展起来的一项新技术，RNA干扰的原理是将与内源性mRNA stranded 同源的外源性双链RNA(doubleRNA，dsRNA)经不同途径导入体 内或体外的组织细胞，致使特定基因沉默。小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是RNA干扰的主要效应因子。利用质粒或病毒为载体， 将基因靶向siRNA导入细胞内，可对特定基因产生沉默效应。本研究以 siRNA表达质粒载体，并转染肝 VEGF．B为靶点，体外构建靶向VEGF．B transcription 癌细胞HepG．2，用逆转录聚合酶链式反应技术(reverse chain polymerase mRNA的表达，研究靶向VEGF．B VEGF．B基 siRNA对肝癌细胞HepG．2 中文摘要 因的抑制作用，为肝癌的基因治疗提供新的靶点和方法，为临床应用提供 理论依据。 siRNA， 方法：扫描分析人类VEGF．B编码序列，设计合成靶向VEGF．B 利用大肠杆菌进行质粒扩增和提取；人肝癌细胞株HepG．2置于DMEM培 5％C02的无菌培养箱中，视细胞生长状态及培养基颜色换液培养。待细胞 培育至呈对数生长，用2．5 g／L胰酶消化并将细胞接种于6孔培养板，待细 2000将实验组及对 胞铺满率达80％后，按转染试剂说明书用Lipofectamine 验组及对照组肝癌细胞VEGF．B 准)。 结果： 1、将重组的靶向VEGF—BsiRNA质粒转入大肠杆菌进行扩增，利用高 siRNA质 纯度小量质粒提取试剂盒，可成功提取纯度较高的靶向VEGF．B 粒。 siRNA成功转染 2、以质粒(含荧光标记)为载体