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草莓镶脉病毒粒子提取及电镜观察方式分析 　摘要：从受感染的草莓（Fragaria sp）植株中提取了草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）粒子并对其进行了电镜观察。用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸，设计SVBV外壳蛋白基因特异性引物，利用PCR方法对杭州地区的草莓镶脉病毒感染情况进行检测。检测结果表明，在杭州地区大田种植的草莓中存在SVBV感染现象。从4株受感染草莓植株中分离克隆了SVBV的CP基因片段并测序；序列比较分析发现它们与已报道的美国SVBV分离物的CP基因（序列号NC_001725）核苷酸同源性为91%。利用差速离心法从上述草莓植株的叶片中提纯SVBV病毒，在透射电镜下观察到SVBV病毒粒子呈球形，直径约为40～55 nm。 　关键词：草莓镶脉病毒（SVBV）；PCR检测；病毒提取；电镜观察 　中图分类号：S432.4+1；S431.192 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4313-03 　草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，简称SVBV）在世界上分布广泛，对草莓（Fragaria sp）危害较为严重，也是中国草莓生产的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、辽宁、山东等地区均有发生[1，2]。SVBV在分类上属花椰菜花叶病毒（Caulimoviruses，CaMV），是一种双链DNA病毒，以半持久性方式通过蚜虫或嫁接传播。SVBV侵染可削弱草莓生长势，降低产量及品质；而与其他病毒或细菌、真菌复合侵染则会造成严重病害发生，给草莓的生产带来严重损失[3，4]。 　Petrzik等[5]1998年测定了SVBV美国加州分离物的全基因组序列，并在此基础上发展了该病毒的PCR检测。目前，国内外众多研究者已利用PCR方法检测了不同的SVBV分离物[6-12]。研究表明，由于SVBV来源、地域不同，基因组存在着分子变异，分子检测方法也有所不同。其中，外壳蛋白在SVBV中的保守性较好，不同地区中SVBV不同分离物外壳蛋白基因间分子变异较小，通常作为PCR检测的首选区域。 　虽然已对SVBV建立了高效、灵敏的PCR检测方法。但在开展大规模病毒调查时，血清学检测手段则更加简单和实用。目前SVBV仍无商品化的抗血清检测试剂，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测较难实施。本研究用超速离心法从感染草莓镶脉病毒（SVBV）的草莓叶片中提纯SVBV病毒，为进一步制备SVBV抗血清和单克隆抗体提供有效的抗原基础。 　1 材料与方法 　1.1 材料 　从浙江杭州地区采集带疑似病症和无症状草莓植株，盆栽种植于大棚，选取新鲜草莓叶片作为试验材料。草莓品种为红颊。 　1.2 方法 　1.2.1 病毒检测 　1）草莓叶片总核酸提取 参照文献[11]采用改进的CTAB法抽提草莓总核酸。将少量草莓叶片在液氮中迅速研碎，取约50 mg粉末加入盛有500 mu;L CTAB提取缓冲液（2% CTAB；100 mmol Tris， pH 8.0；20 mmol EDTA；1.4 mmol NaCl；使用前加入2%beta;-巯基乙醇）的1.5 mL Eppendorf 管中，65 ℃水浴20 min。用等体积氯仿/异戊醇（24︰1）抽提2次，上清液中加入1/10体积的3 mmol/L NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积无水乙醇，反复颠倒数次，取沉淀。70%乙醇洗涤沉淀2次，放置在超净工作台上吹干，加入50 mu;L DEPC水溶解。用紫外分光光度计测定其OD260 nm。 　2）PCR反应体系 根据GenBank中的SVBV基因组序列，参照文献[12]设计同源引物B1F（5prime;-GAATGGGACAATGAAATGAG-3prime;）和B1R（5prime;- GTGAGGAGAACTTAGGACA-3prime;）。所用引物由上海英骏生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系总体积为20.0 mu;L，其中包括模板DNA 1.0 mu;L、引物（10 mu;mol/L）0.5 mu;L， Taq DNA聚合酶（5 U/mu;L） 0.2 mu;L，dNTP（10 mmol/L） 0.4 mu;L，10times;PCR Buffer（含 25 mmol/L MgCl2） 2.0 mu;L，ddH2O 13.4 mu;L。所用试剂购于宝生物（大连）生物工程有限公司。扩增程序为： 94 ℃ 预变性3 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。 　3）目的片段的克隆及测序 利用琼脂糖凝胶回收试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司产品