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蜂产品中溶菌酶含量简易测定方法 　摘　要：利用透析，浓缩提取蜂产品中的溶菌酶，采用紫外可见分光光度法，在285nm处对溶菌酶含量进行检测。结果表明几种样品的溶菌酶含量在34.52μg/g ~ 88.67μg/g，加标回收率95.53% ~ 102.73%，RSD 1.97% ~ 3.65%，讨论了放置时间对蜂产品中溶菌酶的含量影响甚微。该方法设备简单，成本低，方便，易操作。 关键词：紫外可见分光光度法； 溶菌酶； 蜂产品 蜂产品蜜蜂的产物，包括蜂蜜，蜂王浆，蜂胶，蜂花粉等，是营养丰富的天然滋补品，在保健方面有广泛的用途[1]，特别是它们的抗菌作用。蜂产品的抗菌成分主要有葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，溶菌酶等。溶菌酶[2]（Lysozyme）是一种能水解粘多糖的碱性水解酶，相对分子质量14700Da，由129个氨基酸残基构成，碱性氨基酸残基较多，等电点10.8左右，最适PH6-7左右。粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一，溶菌酶能催化水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细胞壁溶解。因此蜂产品中溶菌酶含量高低也是其质量好坏的重要指标。常用的溶菌酶检测方法有：琼脂板扩散法、比浊法、琼脂糖火箭电泳法[3-7]等，这些方法可行且测定结果较准确，但步骤相对复杂，或需要无菌操作。本文利用简易紫外可见分光光度法对几种蜂产品中溶菌酶含量进行检测。 1 实验部分 　　1．1器材及试剂 器材：紫外可见分光光度计(T6新世纪,北京普析通用仪器有限责任公司)；电子分析天平(精确度0.0001上海天普仪器有限公司)；离心机(800型,上海手术器械厂)；透析袋：分子量截留范围8000~10000。 　　试剂： 　　蜂产品：超市及蜂产品专卖店购买（A:蜂王浆，B: 枣花蜜，C:蜂胶（胶囊），D:洋槐蜜-产地1，E：洋槐蜜-产地2）;溶菌酶标准品：南京美博生物科技有限公司; 聚乙二醇(PEG20000); NaCl溶液（0.85%）; EDTA缓冲溶液（pH=8.0）; 磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=6.2) 　　1.2实验方法 　　1.2.1 溶菌酶标准使用液配制 称取溶菌酶标准品0.2500 g溶于250 mL0.85%NaCl溶液中，配成100.00μg/mL的使用液，分别量取使用液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL容量瓶中，用0.85%NaCl定容至刻度，配制成系列应用液，浓度分别为10.00 μg/mL、20.00 μg/mL、30.00 μg/mL、40.00 μg/mL、50.00 μg/mL。 　　1.2.2 溶菌酶最大吸收波长的确定 任取一溶菌酶标准使用液，在紫外分光光度计230~380 nm范围进行光谱扫描，确定最大吸收波长为285 nm 　　1.2.3 溶菌酶标准曲线的绘制 以0.85%的NaCl溶液为参比溶液，在波长285nm处，用1cm比色皿，依次测定各标准使用液的吸光度，以溶菌酶的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标作标准曲线,并计算线性回归方程和相关系数。 　　1.2.4 样品前处理[8-10]与测定 精确称量蜂产品样品5g（蜂胶胶囊1g）于小烧杯中，加入5 ml 0.02 mol/L pH6.2的PBS缓冲溶液使之溶解，取处理好的10cm透析袋（1mmol/LEDTA，PH=8.0中煮沸15 min），将溶解的蜂产品全部装入透析袋中，扎好（做好标记），将透析袋放在0.02 mol/L pH6.2的PBS缓冲溶液中透析4d，每天更换缓冲溶液。之后进行浓缩，将透析袋置入容器中，外面覆以聚乙二醇3~4 min，容器加盖，酶液中水分很快就被聚乙二醇吸收，当浓缩至5mL左右时，用蒸馏水洗去透析袋外聚乙二醇。蒸馏水透析除盐24 h, 收集透析液移至10 mL离心管，以4000r/min离心20 min，将沉淀去除，上清液用0.85%的NaCl溶液定容10 mL。以0.85%的NaCl溶液为参比溶液，在波长285 nm处，依次测定其吸光度 　　1.2.5 回收率实验 取样品B 4份，分别加入溶菌酶1.0、1.5、2.0、2.5 mg, ,每组按1. 2. 6的方法处理后测定溶菌酶含量, 每个样品平行测定5次 2结果与讨论 　　2.1吸收波长的测定 溶菌酶在紫外分光光度计230~380 nm范围进行光谱扫描，结果如图1，确定最大吸收波长为285 nm 　　图1 溶菌酶吸收曲线 　　2.2标准曲线制备 按1. 2. 3的方法进行溶菌酶标准曲线测定,见图2 　　 　　图2 溶菌酶标准曲线 　　得直线回归方程：y = 0.0114x + 0.0101,