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转基因大米中科丰6号及克螟稻检测探究 　 .Hpi152 { display:none; } 转基因大米中科丰6号和克螟稻的检测研究 由于转基因作物种植面积的不断扩展，转基因作物不但广泛进入食品市场，而且已成为饲料行业的主要原料来源[1]。然而，基因工程掌握的不确定性及不可预测性，使得转基因食品安全问题成为目前人类在发展过程中必须面对的一个棘手的环境问题[2]。各国政府纷纷出台了一系列有关转基因及其产品的管理、规定和法规，要求对转基因及其产品进行标注，标明其是否为转基因，让消费者选择[3]。2002年我国农业部颁布的《农业转基因生物标识管理办法》，规定对5大类17种产品必须进行标识[4]。 　大米是我国主粮，我国一直在进行转基因水稻研究，但一直没批准转基因水稻商业化种植。多年来我国出口大米及其制品一直受到转基因问题困扰，严重影响我国出口大米及其制品正常贸易[5-6]。2011年12月23日，欧盟官方公报发布了2011/884/EU号执行决议替代2008/289/EC号决议，将措施管辖的范围扩展到所有在中国米产品中发现的转基因品系，对中国米产品实施史上最为严苛的入境检查。因此，应用转基因大米快速灵敏的检测方法有组织、有针对性的开展对转基因大米样品的检测和监控显的愈发重要，为有关部门提供监管和行政执法的科学依据、帮助食品出口企业突破贸易壁垒等都具有十分重要的意义。 开题报告 http://www.lW54.com/html/lunwenzhiDao/kaitibaogao/ 　1 材料和方法 　1.1 仪器 　高速冷冻离心机3K18型，德国Sigma公司；超纯水处理器Milli-Qplus，法国产；梯度PCR仪MyCyclerTM，美国Bio-RAD公司；电泳仪POWER Pac300，美国Bio-RAD公司；凝胶电泳图像分析系统2000型，美国Bio-RAD公司；恒温摇床，Orbital shaker，Thermo Forma，美国产；7500Fast实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司。 　1.2 材料和试剂 　CTAB提取缓冲液（20g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.1mol/L Tris，20mmol/L NaR2REDTA，pH8.0）；CTAB沉淀缓冲液（5g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl）；TE缓冲液：Tris 0.01mol/L，Na2EDTA0.001mol/L，用HCl或NaOH调节pH至8.0；稀释液：Waters-DEPC treated，上海生工；蛋白酶K：20mg/mL；NaCl溶液，1.2mol/L；无水乙醇、氯仿、异丙醇等有机试剂；荧光定量PCR试剂盒：TaKaRa Premix Ex Taq2times;；样品来源：本实验室检测留样。待测式样见表1，由中国检验检疫科学研究院提供。 　1.3 引物 　根据国内外文献查阅的KF6（科丰6号）和KMD（克螟稻）的引物信息[7-8]，见表2。 　1.4 检测步骤 　1.4.1 样品制备 　（1）取一定重量的检验样品，具体重量按照相关标准执行[7-19]，放到干燥洁净的研磨器中充分研磨约10分钟，样品呈粉末状为佳。 http://www.lW54.com 　*研磨器不能连续运行超过1分钟，中间需暂停，取出转子摇匀样品，再研磨。 　（2）取大约1g研磨好呈粉末状的其他样品加入到15ml离心管中，做好标记，另取约1g阴性样品作为提取对照。 　*取样尽量取最细的。 　1.4.2 DNA提取 　（1）在制备好的样品中加入5mL CTAB提取缓冲液（可加20mu;L蛋白酶K溶液，水浴65℃孵化1h（检查样品材料是否膨胀，样品应只有悬浮在液体中，如材料膨胀，再加入CTAB提取缓冲液，每次1mL）。 　（2）孵育过夜。 　（3）常温离心12000rpm，10min直至悬浮部分几近清澈（注意不能使用冷冻，因为冷冻使部分DNA沉淀）。 　（4）将1mL的上清液转入2mL的离心管中，加入700mu;L氯仿，高速涡旋震荡混合30s。 　（5）常温12000rpm，10min，收集600-650mu;L上清，转移到一个新的2mL离心管，加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液。 　（6）室温（20℃～24℃）孵化60min，12000rpm离心10min。弃上清，将沉淀溶于350mu;L，1.2mol/L NaCl溶液。加入350mu;L氯仿，高速涡旋震荡30s，混匀。 　（7）12000rpm离心15min，小心将上清转移至新的反应管中，加入0.8倍体积的异丙醇，室温（20℃～24℃）孵化至少20min。 总结大全 /hTml/zongjie/ 　（8）12000rpm离心10min，弃上清。加入50