人膜联蛋白A10基因过表达慢病毒的构建和其对人肝癌细胞株HepG2体外效应的研究.pdfVIP

Y1 摘要 摘要 目的： fluorescence 色荧光蛋t刍(Enhancegreen protein，EGFP)融合基因的重组慢病毒； 2、通过检测重组慢病毒对人肝癌细胞株HepG2凋亡、增殖的影响及其对 HepG2细胞中基质金属蛋白酶一9(matrix endothelial 皮生长因子(vascular factor，VEGF)表达的影响。初步阐明 growth 膜联蛋白A10基因在人肝癌增殖、凋亡及转移中的作用。 方法： 1、针对已经筛选确定的ANXAl0基因并将基因克隆转入到慢病毒载体表达 10。 慢病毒PGC．Fu．ANXA 2、体外实验中，将上述慢病毒以最适MOI转染人肝癌细胞株HepG2，分成 ANXAl0．慢病毒组、慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组。荧光显微镜观察 的变化，采用Western 法测定其对人肝癌细胞株HepG2凋亡及增殖情况，并运用同样的方法分别从 mRNA和／或蛋白质水平检测MMP9、VEGF表达的变化。 结果： 1、成功构建人ANXAl0基因过表达慢病毒，测序验证序列正确，经包装产 生的病毒滴度为2E+8。 后3．4d 使其终浓度为5}tg／ml，转染效果更佳。 3、人ANXAl 72h后的 0基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG2 T 摘要 达24．646％，与慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组比较差异有统计学意义(P0． 05)，而慢病毒空载组HepG2细胞生长抑制率与HepG2细胞未转染组比较无明 1．41％， 显差异(P0．05)；凋亡实验显示，ANXAl0．慢病毒组细胞凋亡率为51．92_-L 慢病毒空载组细胞凋亡率为19．00-士1．12％，HepG2细胞未转染组细胞凋亡率为 (PO．05)。 4、转染HepG2细胞后，采用半定量RT-PCR技术及Westernblotting技术检 测结果显示，与慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组比较，ANXAl0．慢病毒组 中ANXAl0 mRNA及ANXAl0蛋白表达明显升高(PO．05)。 5、人ANXAl0基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG2后，显示 ANXAl0．慢病毒组MMP．9、VEGFmRNA和蛋白的表达量较慢病毒空载组和 HepG2细胞未转染组相比均明显下降(P0．05)。 结论： l、人ANXAl0基因过表达抑制人肝癌细胞株HepG2增殖并促进其凋亡。 2、人ANXAl0基因过表达能下调HepG2中肝癌侵袭转移相关的细胞因子 MMP．9、VEGF的表达，并可能由此进一步抑制肝癌的侵袭转移。 关键词：慢病毒；膜联蛋白AlO；基质金属蛋白酶．9；血管内皮生长因子；人肝 癌细胞株HepG2；半定量RT—PCR：免疫蛋白印迹；流式细胞技术：四 甲基偶氮唑盐比色法 II Abstract ABSTRACT objective： annexin一1 1．Toconstructhuman I Enhancefluorescent 0(ANⅪAO)and green