凝血酶是治疗移性骨桥蛋白阳性肝细胞肝癌的靶点.pdfVIP

博士论文 中文摘要 凝血酶是治疗转移性骨桥蛋白阳性肝细胞肝癌的靶点 中文摘要 我们实验室之前的研究表明骨桥蛋白(OPN)是促进肝细胞肝癌侵袭转移的 关键分子之一，并且通过体内外试验确定为干预肝细胞肝癌侵袭转移潜在的靶 点。而丝氨酸蛋白酶凝血酶能和骨桥蛋白相互作用并且调节它的生物活性。为了 研究凝血酶单独以及与骨桥蛋白协同在肝细胞肝癌的作用，我们在具有不同的骨 桥蛋白表达水平肝癌患者中，研究了凝血酶的表达水平与不同骨桥蛋白背景的肝 癌患者预后的联系。我们发现凝血酶的表达水平与肝癌细胞株的转移潜能密切相 关，并且与癌旁组织相比，癌组织的凝血酶表达水平显著上升。另外，发生复发 的患者的癌组织与未复发的患者相比，凝血酶的表达水平显著升高。对230例患 者的免疫组化研究表明，只有骨桥蛋白表达水平较高的患者，凝血酶的表达水平 试验表明，凝血酶能够有效促进骨桥蛋白过表达肝癌细胞株的增殖和黏附能力， 体内试验证明凝血酶有效促进了人肝癌细胞在裸鼠体内的肺转移，同时人肝癌裸 鼠体内肺转移可被凝血酶抑制剂阿加曲班所抑制。并且在体外观察了原核表达的 骨桥蛋白全长与凝血酶切片段对肝癌细胞增殖与黏附能力的影响，发现氨基端片 段比全长拥有更强的促增殖与黏附能力。同时外源性凝血酶的处理能够激活骨桥 蛋白高表达细胞株FAK信号通路，并且这种激活效应能够被整合素拮抗性抗体 所阻断。结论：凝血酶在骨桥蛋白介导的侵袭性表型和肝细胞肝癌较差预后中发 挥重要作用，这种作用可能是通过激活整合素受体．FAK信号通路引起的。因此， 凝血酶可能是对抗凝血酶骨桥蛋白双阳性患者侵袭转移潜在的靶点。 第一部分凝血酶在肝细胞肝癌中高表达 目的：通过检测肝癌组织、癌旁和正常肝组织中凝血酶的mRNA与蛋白表达以 及不同转移潜能肝癌细胞以及正常肝细胞凝血酶的mRNA与蛋白表达，分析其 与肝癌恶性行为的关系。 blot检测凝血酶在肝 方法：应用荧光定量PCR、免疫组织化学技术以及Westem 癌、相应癌旁、正常肝组织中的表达，并比较三组间凝血酶的表达差异：应用荧 光定量PCR及Westernblot检测不同转移潜能肝癌细胞以及正常肝细胞凝血酶的 mRNA与蛋白表达，比较不同细胞株之间凝血酶的表达差异。 结果：通过荧光定量PCR以及Westernblot技术，发现六株肝癌细胞株与正常肝 细胞株(L．02和Changliver细胞株)相比，凝血酶的mRNA和蛋白表达水平显著 上调。以HepG2、PLC和MHCC97一L细胞株为代表的低转移潜能肝癌细胞和以 博士论文 中文摘要 能肝癌细胞株相比，高转移潜能细胞株凝血酶的mRNA和蛋白表达水平显著上 肝癌组织以及相应的癌旁组织凝血酶mRNA的表达水平。凝血酶在肝癌、相应 癌旁和正常肝组织中均有表达，相对表达量分别为(2-ACt137．44-69．1)，2．7±0．1 (p0．05)。同时，凝血酶在肝癌组织mRNA的表达水平与肝癌复发正相关(P= blot结果的验证。免疫组织化学显示凝血酶主要分 0．037)，这点得到了Western 布于细胞周质，其在肝癌组织中的表达明显高于癌旁(p0．05)。 结论：凝血酶在肝癌细胞株以及肝癌组织中高表达，并且凝血酶在肝癌的恶性行 为中可能具有重要作用。 第二部分凝血酶屑桥蛋白与肝癌临床病理特征及预后的关系 目的：研究凝血酶和骨桥蛋白在原发性肝癌中表达，探讨凝血酶和OPN与原发 性肝癌侵袭转移的关系及临床生物学意义。 方法：应用荧光定量PCR检测72例肝癌组织中凝血酶与OPNmRNA的表达， 免疫组织化学技术检测230例肝癌组织中凝血酶与骨桥蛋白的表达，SSPSl5．0 分析两者与肝癌临床病理特征及预后的关系。 结果：肝癌组织凝血酶和骨桥蛋白mRNA表达水平的相关性分析表明，它们的 表达量并不存在联系p=一0．17，P=0．15)。为了观察凝血酶是否参与了骨桥蛋白 相关肝癌患者的预后，我们根据骨桥蛋白表达水平的中位值作为阈值将肝癌患者 分为低表达和高表达组。发现在骨桥蛋白高表达组，复发患者的凝血酶表达水平 比未复发的患