加味丹参饮预处理对乳鼠缺氧-复氧心肌细胞延迟保护作用及对蛋白激酶C影响.docVIP

加味丹参饮预处理对乳鼠缺氧/复氧心肌细胞延迟保护作用及对蛋白激酶C影响摘要：目的 观察加味丹参饮预处理对乳鼠缺氧?氧心肌细胞的延迟保护作用及对蛋白激酶C(PKC)的影响。方法 将培养72 h的乳鼠心肌细胞随机分为6组，空白组正常培养；血清对照组加50％大鼠血清培养；含药血清?加50％含加味丹参饮的药物血清培养；缺氧/复氧组予缺氧再给氧。缺氧预处理组、加味丹参饮预处理组先给予缺氧预处理和加味丹参饮预处理，24 h后再予缺氧再给氧。结果 加味丹参饮预处理24 h后可防止缺氧/复氧心肌细胞存活率的降低，防止乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性的升高(P＜0.01)，提高蛋白激酶C活性(P＜0.01)。结论 加味丹参饮预处理具有延迟保护作用，其机制与激发细胞内PKC信号转导通路有关。 关键词：加味丹参饮；预处理；延迟保护；心肌细胞；蛋白激酶C 中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1672－1349(2007)10－0953－03 反复短暂缺血一再灌注以激发自身的适应性反应，使心肌对随后发生的持续性缺血的耐受力提高称为缺血预处理(IPC)。缺血预处理可防止心肌缺血再灌注损伤，具有良好的临床应用前景。IPC对心肌的保护作用分为早期保护作用(EPC)与延迟保护作用(DPC)。目前关于中药复方延迟保护作用的研究较少。本研究观察加味丹参饮预处理的延迟保护作用，并观察其对蛋白激酶C(PKC)的影响，以期为临床应用提供实验依据。 1　材料与方法 1．1　材料 1．1．1　动物 出生72 h的Wistar大鼠30只，成年大鼠10只，体重(200±20)g，雌雄各半，均由广西医科大学医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2003～0003。 1．1．2　药物 加味丹参饮由丹参20g、檀香6g、赤芍10g、川芎6g、当归6g、红花6 g、生地12g等组成。由湖南中医药大学第一附属医院药房提供，经干燥、称重、浸泡、煎煮3次，浓缩至含生药2g/mL。 1．1．3　仪器及试剂 凝胶成像分析系统(BIORAD公司)、U－2001紫外分光光度计(日立公司)、低温高速离心机(Sigma公司)、PepTag非放射性蛋白激酶试剂盒(Promega公司)、WIP组织细胞裂解液(北京博奥森生物技术有限公司)、乳酸脱氢酶(LDH，南京建成生物工程研究所)、肌酸激酶(CK，南京建成生物工程研究所)、DMEM(Gibeo公司)、胎牛血清(杭州四季清生物工程材料有限公司)、牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)。 1．2　方　法 1．2．1　体外大鼠心肌细胞的培养 参照《药理实验方法学》中新生大鼠心脏细胞的培养方法，将出生72 h的30只Wistar大鼠，无菌条件下剪取心室。剪下的心脏用PBS(磷酸缓冲液)洗涤后，剪去心房，将心室剪成1 mm3碎块，用0.125％胰蛋白酶37℃水浴中消化10 min，弃上清，再加入胰蛋白酶液消化10min，将上清液及沉淀物分别处理。上清液移至另一无菌离心管中，加入PBS离心，弃上清液。重复(1～3)次，充分洗去胰蛋白酶。消化处理之后，将心肌细胞加入含20％胎牛血清的DMEM培养液中制成细胞悬液。将沉淀组织块再加胰蛋白酶消化，沉淀，其上清液重复前述步骤，反复消化(3～8)次，制成心肌细胞悬液。将所有细胞悬液移到细胞培养瓶中，于37℃5％CO2培养箱中放置1.5 h，除去已贴壁的成纤维细胞。收集未贴壁的细胞悬于含20％胎牛血清的DMEM培养液中，调细胞浓度为3×106/mL，接种于25 cm2的培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。每2d更换培养液，取培养3d的细胞单层进行实验。 1．2．2　心肌细胞缺氧?氧(H/R)损伤实验法 参照《药理实验方法学》进行。DMEM培养液用高纯氮气饱和30 min，使培养液氧分压低于4.00 kPa(30 mmHg)。心肌细胞单层换用缺氧培养液后。培养液内立即冲入氮气(1L/min流量)30 s以驱除瓶内氧气，然后塞紧瓶塞密闭培养。缺氧不同的时间后可造成心肌细胞不同程度的损害。按此方法造成心肌细胞缺氧，缺氧3h后换用正常DMEM培养液培养1h，造成再给氧损伤。 1．2．3　药物血清制备 参照《药理实验方法学新技术与新方法》中方法。取10只Wistar大鼠按区组随机法分为血清对照组和药物血清组，分别制备对照血清和药物血清。药物血清组灌胃加味丹参饮药液，剂量是根据成人每日临床用量按人与动物之间药物剂量换算而成(利用mg/kg折算mg/m2转换因子”进行计算)，大鼠每日药量为6.42 g/kg，每日2次，连续3d。血清对照组灌以等量生理盐水。于最后1次给药后1 h，无菌条件下，颈总动脉取血，分离血清；56℃、30min灭