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三种脱钙液对骨组织免疫组化染色影响[摘要] 目的 探讨三种脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响。 方法 选择12例骨组织，随机分为3组。A组用14%硝酸脱钙液进行处理，B、C组分别用EDTA脱钙液、PLANK脱钙液进行处理，同时对CD3、CD68、Ki—67 和TTF—1染色。 结果 室温条件下，硝酸脱钙液的脱钙时间最短，但对组织损伤最大。PLANK脱钙液和EDTA脱钙液脱钙效果较好，组织结构完整，形态清晰，免疫组化染色较好。 结论 室温条件下，三种脱钙液中PLANK脱钙液和EDTA脱钙液对骨组织脱钙及免疫组化染色效果较好。但由于EDTA脱钙液脱钙时间过长，PLANK脱钙液脱钙均匀，速度快，更适合用于临床病理检查。硝酸脱钙液脱钙最快，但是免疫组化染色效果较差。 [关键词] 脱钙液；骨组织；免疫组化染色 [中图分类号] R446.4+1 [文献标识码] B [文章编号] 1673—9701（2012）24—0101—03 骨组织内含有大量无机钙盐，结缔组织坚硬，难以直接制片[1]。如果强制切片，在蓝色钙盐背景下，往往无法看清细胞结构，所以需要选择一种能保持骨组织形态结构和染色后有利于保持细胞结构清晰度和对比度的脱钙液。本文研究14%（体积分数）硝酸脱钙液、EDTA脱钙液、PLANK脱钙液对骨组织免疫组化染色的影响，以期寻找一种效果比较理想的脱钙液，对病理诊断工作提供帮助。 1 材料与方法 1.1 标本选择 12例骨组织标本均来源于我院，切成1 cm×1 cm×0.3 cm的骨块，在福尔马林中性液内固定24 h，用于脱钙及免疫组化染色实验。 1.2 三种脱钙液 ①脱钙液Ⅰ：14%（体积分数）硝酸脱钙液，配制方法为14 mL浓硝酸加入86 mL蒸馏水；②脱钙液Ⅱ：EDTA脱钙液，配制方法为EDTA10 g，蒸馏水100 mL，加NaOH充分搅拌溶解，在用10 mol/L的HCl调pH为8.0，最后加入4%甲醛15 mL。③脱钙液Ⅲ：PLANK脱钙液，配制方法为氯化铝10 g，甲酸50 mL，10%福尔马林10 mL，冰乙酸1.5 mL，加蒸馏水至总体积100 mL。 1.3试剂和仪器 硝酸、盐酸、EDTA等化学试剂均购自广州化学试剂一厂，CD3、CD68、Ki—67和TTF—1等抗体购自福建迈新公司，EnVision二步法试剂盒购自DAKO公司。切片机、染色机和切片刀购自英国shandan公司。 1.4 方法 1.4.1 脱钙处理 三组骨组织分别按以下方法进行脱钙处理：将12例骨组织标本平均分为A、B、C三组，并确定所选每份骨组织性质一样，分别将A、B、C组标本放入相对应的脱钙液中，间隔一定时间后更换脱钙液，以标本肉眼观察至半透明状，手感有弹性，大头针可顺利刺进骨组织，无砂粒感为脱钙完成，结合X射线确定脱钙终点。接着进行石蜡切片、免疫组化染色。 1.4.2 免疫组化染色步骤 骨组织固定、脱钙后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋及制成4 μm厚的连续切片，裱片后进行70℃烤片1 h，脱蜡至乙醇溶液，3%（体积分数）甲醇—H2O2封闭内源性过氧化酶10 min，高压锅枸橼酸缓冲液法修复2 min，加入Ⅰ抗，37℃孵育1 h，加入EnVisionⅡ抗，再于37℃孵育30 min，DAB显色1 min，苏木精复染（图像分析所用的切片未染色），脱水，透片，封片，光镜观察。 1.4.3 免疫组化染色结果判定 CD3阳性信号位于细胞膜、CD68阳性信号位于细胞浆、Ki—67和TTF—1阳性信号位于细胞核。于光镜下观察三种脱钙液脱钙骨组织免疫组化标记的结果，未复染的切片做图像定量分析，其方法为：将每种抗体免疫组化染色后的切片放在显微镜下，在同一组的每张切片相同的部位观察10个视野（4种抗体×10=40个视野），被测物质的各种信息通过摄像机将所测目标转换成数字图像，传递到计算机系统，标定组织片空白处入射光的光密度值（OD值），在监视器上用不同的分割方法和编辑功能，计算免疫组化染色阳性细胞平均OD值，其值代表了切片中相应抗原性的相对强度。 1.5 统计学分析 图像分析结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0作方差分析。 2 结果 2.1 不同脱钙液对骨组织脱钙时间及效果比较 2.1.1脱钙时间 14%硝酸脱钙液脱钙时间最短。14%硝酸脱钙液PLANK脱钙液EDTA脱钙液（表1）。 2.1.2脱钙效果 14%硝酸脱钙液脱钙效果最好。14%硝酸脱钙液﹥PLANK脱钙液﹥EDTA脱钙液（表1）。 2.1.3对组织损伤 EDTA脱钙液对组织损伤最小。EDTA脱钙液PLANK脱钙液14%硝酸脱钙液。见表 1。 2.2 不同脱钙液脱钙对骨组织免疫组化染色结果比较 见表