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复旦大学博士研究生论文 中文摘要 年龄相关性白内障晶状体蛋白磷酸化位点鉴定 中文摘要 relatedcataract， 白内障是全球首位致盲眼病，而年龄相关性白内障(age ARC)也是老年人视力下降的主要原因。目前手术仍是治疗白内障唯一有效的方 法，由于我国人口数量庞大，经济欠发达，高昂的手术费用会给社会带来沉重的 经济负担。因此，预防或者推迟ARC发病，无疑具有重要意义。 磷酸化是一种常见蛋白质翻译后修饰，磷酸化与去磷酸化这一可逆的过程调 节着信号传导、基因表达等多种细胞生物学进程，而蛋白质磷酸化修饰的异常会 引发一系列疾病。晶状体蛋白是人晶状体内含量最高的结构与功能蛋白，研究者 推测晶状体蛋白的磷酸化与去磷酸化的过程失调可能是ARC发病的早期改变或 者说是晶状体蛋白变性前的病变。 由于晶状体蛋白磷酸化过程是可逆的，因此在晶状体蛋白尚未发生变性的早 期，也即白内障形成之前是干预ARC发病的有效时机。鉴定晶状体蛋白的磷酸 化位点，将是进一步探索位点功能的第一步。 本实验首次利用原位酶解联合基质辅助激光解析电离质谱鉴定人透明晶状 体与ARC晶状体组织切片中的磷酸化位点。研究者在人透明晶状体中鉴定到了 4种晶状体蛋白中的8个磷酸化位点；在ARC晶状体中鉴定到了6种晶状体蛋 白中的11个磷酸化位点，其中9个磷酸化位点先前未有报道。 本实验为进一步的磷酸化位点质谱成像定位和磷酸化位点的功能学研究奠 定了基础。 中图分类号：R776．1 复旦大学博士研究生论文 中文摘要 第一部分 晶状体冰冻切片及质谱鉴定条件的优化 目的：探求人晶状体组织冰冻切片的最佳条件并优化基质辅助激光解析电离质谱 对晶状体组织切片鉴定的实验参数。 下沿赤道部轴向切片，切片厚度10 J-tm至20I．tm，用解剖镜观察所得切片，确定 最适宜的温度与切片厚度。 (2)使用标准蛋白细胞色素C与马心肌红蛋白作为标准蛋白，从基质种 类、基质喷涂层数、喷涂速度等各方面优化并探寻最佳的基质辅助激光解析电离 质谱鉴定晶状体组织切片中磷酸化位点的实验参数。 结果：经过解剖镜观察，最适宜的切片温度为．18C，切片厚度为14I．tm。此条件 下切片完整性好，易于转移和进一步的质谱鉴定。基质辅助激光解析电离质谱鉴 定人晶状体组织切片的最佳实验条件为：以加入0．1％--+氟乙酸、0．6．0．8mg／ml 柠檬酸氨的浓度为2．5mg／mL的0【．氰基．4．羟基．肉桂酸(50％乙腈：50％水)为基 质，直接喷涂在组织切片表面；加热温度120℃，基质流速0．100ml／min，喷头 进行后期处理。 结论：确立了人晶状体组织冰冻切片的最佳条件，并优化了基质辅助激光解析电 离质谱对人晶状体组织切片鉴定的实验条件与实验参数，为进一步的研究奠定了 基础。 关键词：年龄相关性白内障，磷酸化，冰冻切片，基质辅助激光解析电离质谱 复旦大学博士研究生论文 中文摘要 第二部分 原位酶解结合基质辅助激光解吸电离质谱鉴定晶状体蛋白磷酸化位点 目的：在优化了的实验条件下，利用原位酶解联合基质辅助激光解析电离质谱鉴 定年龄相关性白内障晶状体及人透明晶状体中晶状体蛋白的磷酸化位点并比较 其差异。 方法：(1)将．80℃冻存的人透明晶状体与年龄相关性白内障晶状体在．18℃温度 下沿赤道部轴向切片，切片厚度149m，随后将组织切片转移至盖玻片上。 (2)用肌红蛋白、牛血清白蛋和a．酪蛋白作为标准蛋白对胰蛋白酶．石墨 烯固定化酶反应器的酶解效率进行考察。 (3)利用胰蛋白酶．石墨烯固定化酶反应器联合基质辅助激光解析电离质 谱鉴定人透明晶状体与年龄相关性白内障晶状体组织切片中的磷酸化位点，所得 质谱数据使