急性白血病组蛋白甲基化及DNA甲基化的相互作用及对Wnt信号通路的调控研究.pdfVIP

中 文 摘 要 急性白血病组蛋白甲基化和DNA 甲基化的相互作用及对Wnt 信号通路的调控研究 急性白血病是一个多因素相关的疾病。研究发现，急性白血病的发生、发展、 治疗疗效及预后与异常的表观遗传学有关。表观遗传学（epiginetics）是研究 不涉及DNA 序列变化的、可遗传的基因表达的改变。它主要通过DNA 甲基化、组 蛋白翻译后修饰、RNA 相关沉寂和染色质重塑等多种修饰机制调控基因的表达， 是肿瘤发病的重要机制之一。目前研究较多的是单一的抑癌基因DNA 甲基化和组 蛋白乙酰化、组蛋白甲基化等修饰形式，对于不同修饰形式之间的相互作用及对 基因表达的调控机制等研究尚不明确，是近年来表观遗传领域的研究热点。Wnt 信号转导通路(wingless pathway)是一条保守的信号通路，参与调节细胞的生 长、迁移、分化及凋亡，是肿瘤发生过程中的关键信号通路之一。研究发现，Wnt 通路的异常活化与肿瘤的形成密切相关。 本课题以Wnt 通路拮抗基因为靶基因，拟通过双向干预DNA 甲基化和组蛋 白甲基化模式的平衡，探讨Jurkat 细胞中DNA 甲基化和组蛋白H3K9 甲基化的 相互作用及对靶基因的表达调控机制，研究其对 Jurkat 细胞生物学活性和 Wnt 信号通路传导的影响，揭示急性白血病的表观遗传学发病机制，挖掘新的靶分子， 为白血病早期诊断和基因靶向治疗提供新的思路。 课题分为以下四部分： 1、以Western Blot方法检测急性白血病患者及7种恶性血液病细胞系的组蛋 白H3K9、H3K4总甲基化水平，分析其与急性白血病发生、发展、治疗效果及预后 之间的关系。 2、以 H3K9me3 组蛋白高甲基化的急性淋巴细胞白血病 Jurkat 细胞系为研 究对象，通过染色质免疫分析联合芯片（CHIP on chip）技术筛选出与H3K9me3 甲基化位点相关的Wnt 信号通路拮抗基因WNT5A、DKK3、SFRP2 作为靶基因， qPCR 法检测靶基因表达情况；并以甲基化特异性PCR（MSP）方法检测靶基因 启动子区 DNA 甲基化水平，分析组蛋白甲基化和 DNA 甲基化两种表观遗传修 3 饰机制之间的相关性，及与Wnt 信号传导通路的联系。 3、构建针对组蛋白H3K9me3 位点甲基转移酶SUV39h1 基因的干扰质粒转染 Jurkat 细胞，沉默该基因以逆转H3K9 组蛋白甲基化；同时以经典的DNA 去甲基 化药物5-Aza-CdR 去除靶基因启动区DNA 甲基化，从DNA 和组蛋白甲基化双向调 控机制入手，以Western Blot、MSP、ChIP-qPCR 等方法研究各自甲基化平衡模 式被打破后，另一方对应的 DNA/组蛋白甲基转移酶、DNA/组蛋白甲基化水平和 靶基因表达的改变，探讨DNA 甲基化和组蛋白甲基化之间的相互作用和对靶基因 的表达调控机制。 4、以未处理组为正常对照，研究 5-Aza-CdR 处理组和SUV39h1 基因敲除组 对Jurkat 细胞的生长曲线、增殖活性、克隆形成能力、细胞周期以及凋亡水平等 细胞生物学活性的影响，并以 Western Blot 法检测 Wnt 通路关键效应蛋白 β-catenin 的表达改变，探讨DNA/组蛋白甲基化修饰对Jurkat 细胞生物学活性及 Wnt 信号通路的影响。 结论如下： 1. 组蛋白 H3K9me3 高甲基化和组蛋白 H3K4 低甲基化在急性白血病中广 泛存在，且与白血病的分型、治疗疗效和预后相关。 2. Jurkat 细胞组蛋白H3K9me3 甲基化与Wnt 信号通路拮抗基因（SFRP2、 DKK3、WNT5A）启动区DNA 的高甲基化状态有关。 3. DNA 去甲基化可引起组蛋白 H3K9 甲基化水平及组蛋白甲基转移酶 SUV39h1 和 G9a 的表达下调，激活靶基因表达；在体外能够抑制Jurkat 细胞增 殖，阻滞细胞周期进程，并诱导凋亡，其作用机制与通过抑制 Wnt/β-catenin 信 号途径有关。 4.组蛋白H3K9 去甲基化，可引起DNA 甲基转移酶DNMT1、DNMT3A 和 DNMT3B 的表达下调，但对DNA 甲基化无明显改变，靶基因表达增加；在体外 能够抑制Jurkat 细胞增殖，阻滞细胞周期进程，并诱导凋