慢病毒介导Galectin-3基因沉默对垂体泌乳素腺瘤细胞的作用.pdfVIP

Classified Index: CODE:10075 U.D.C: NO A Dissertation for the Degree of M. Medicine The Effects of Silencing Galectin-3 Expression by Lentiviral-mediated RNA Interference on the Prolactinoma Cells Candidate: Gao Pu Supervisor: Prof. Wang hong Academic Degree Applied for: Master of Medicine Specialty: Surgery University: Hebei University Date of Oral Examination: May, 2012 摘 要 摘 要 目的：通过在泌乳素腺瘤细胞中对 Galectin-3 进行体外基因敲减，为治疗泌乳素腺瘤提 供实验基础，为下一步体内进行垂体泌乳素腺瘤的 Galectin-3 基因敲除提供重要依据， 初步探讨 Galectin-3 在泌乳素腺瘤的发生、发展中的作用机制。 方法： 1.泌乳素腺瘤细胞培养及激素水平的测定：选取经单鼻孔蝶窦入路手术切除的泌乳 素腺瘤组织，采用悬浮细胞培养法，定时观察泌乳素腺瘤细胞的生长情况，并进行激素 分泌功能测定。 2. 重组慢病毒载体介导 Galectin-3 基因沉默对泌乳素腺瘤细胞的影响的体外研究 Galectin-3shRNA 慢病毒载体（将其命名为 LV- shRNA- Galectin-3 ）由上海吉凯技术 有限公司包装制备。 将培养的泌乳素腺瘤细胞进行实验分组，分为转染组（LV- shRNA- Galectin-3 ）,阴 性对照组（为无关序列的发夹结构病毒载体, 由上海吉凯基因提供）和空白对照组（未加 任何质粒）。将慢病毒载体转染目的细胞，分别用Real-time PCR 和 Western blot 的方法 检测慢病毒载体对 Galectin-3 的敲除效率，MTT 法检测泌乳素腺瘤细胞的活力，确定 LV- shRNA- Galectin-3 介导的 RNAi 对泌乳素腺瘤细胞增殖及凋亡的影响。 3.统计学方法 实验数据采用 SPSS16.0 统计软件进行分析，各组之间的比较采用方差分析，两两 组间比较采用 SNK 法。 结果： 1. 泌乳素腺瘤细胞的培养及激素水平测定。 相差倒置显微镜下观察，原代培养的泌乳素腺瘤细胞呈椭圆形或梭形，24h 后有部 分泌乳素腺瘤开始半贴壁生长，大部分呈悬浮生长。于培养的约第 10 天开始，成纤维 细胞数量开始增多，并逐渐取代泌乳素腺瘤细胞。换下的培养液采用放射免疫方法检测。 测定结果显示泌乳素腺瘤细胞分泌的激素水平在第 7 天左右最佳。 2.shRNA 在泌乳素腺瘤细胞中对 Galectin-3 敲减效率。 Real-time PCR 结果显示 LV- shRNA- Galectin-3 转染泌乳素腺瘤细胞后，其 I 摘 要 Galectin-3 的mRNA 的表达比未敲减组降低了70% 以上，p ＜0.05，阴性对照组和空白组 表达水平没有明显下降。 Western Blot 检测结果显示，shRNA 明显降低泌乳素腺瘤细胞中Galectin-3