申克氏孢子丝菌酵母相菌丝相差异蛋白的筛选及鉴定.pdfVIP

申克氏孢子丝菌酵母相菌丝相差异蛋白 的筛选与鉴定 硕士生姓名： 侯彬彬 专旨导教师： 刘晓明教授 指导小组： 刘晓明教授 张振颖 医师 专业名称： 皮肤病与性病学 摘 要 孢子丝菌病是双相型真菌申克孢子丝菌所致的皮肤，皮下组织及其 附近淋巴管的亚急性和慢性感染，主要累及四肢和颜面等暴露部位，表 现为肉芽组织损害，偶尔累及黏膜、肺、脑膜和其他内脏器官。孢子丝 菌是腐生真菌，在世界广泛分布，可污染土壤、芦苇、动物的皮毛、污 水等。人类常因外伤直接接种致病。申克孢子丝菌为双相型真菌，室温 培养为菌丝相，组织内和37℃培养为酵母相。其酵母相能引起上述皮肤、 皮下组织、黏膜和局部淋巴系统甚至全身多系统的损害，而菌丝相则不 会。这种双相真菌的致病性和其双相型的转换密切相关。目前，对于孢 子丝菌双相转换与致病蛋白二者关系的研究尚未见报道，而其他双相真 菌在这方面的研究有很多报道，很多蛋白被推测及鉴定出来。研究均证 实了在酵母相中有差异蛋白的高表达，通过比较，我们课题组将进一步 研究申克氏孢子丝菌双相转换中差异蛋白的表达情况，并寻找出在其诱 导转换机制扮演重要角色的蛋白质。 目的：筛选孢子丝菌菌丝相酵母相差异蛋白，寻找有关双相转换的 致病蛋白，为明确孢子丝菌的发病机理及寻找靶向治疗药物奠定重要的 基础。 材料和方法：对孢子丝菌标准株分别进行茵丝相和酵母相的培养，并 提取其各自的总蛋白，纯化。并找出适合孢子丝菌蛋白双相电泳的条件， 进行蛋白的分离，得出相关的蛋白图谱，经Pdquest软件分析，选取相 关的差异蛋白经处理后进行质谱检测，最后得到相关的具体的蛋白。 结果： 1、申克氏孢子丝菌25℃之后，在光镜下可见到细长的菌丝体，转 入BHI培养基37℃培养24小时后菌体断裂，48小时时完全变成单个孢 子。 2、在进行孢子丝菌双向电泳时，选择蛋白上样为5099，载体两性 电解质PH：4-6，经2D Kit充分纯化并行考马斯亮蓝染色可获 clean．Up 得清晰的蛋白质双向电泳图谱，适用于蛋白质组学研究。 3、孢子丝菌蛋白双向电泳结果测得差异蛋白300多个，其中酵母相 高表达的200多个，低表达的l00多个。 4、经质谱分析及NCBI数据库检索得到可能有意义的蛋白：DRKl 组氨酸激酶，熟休克蛋白77伴88，肌动蛋白，细胞色素P．450，苏／丝 氨酸激酶等以及一些假想蛋白。 结论： l、孢子丝菌确实有在随温度变化而出现形态转化，25℃为菌丝相， 37℃为酵母相。 2、蛋白上样量、纯化方法、载体两性电解质PH选择范围，染色方 法均影响双向电泳的结果。 3、建立了孢子丝菌菌丝相酵母相的双向电泳图谱。 酰基酶，DRKl组氨酸激酶，苏／丝氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇3．激酶。 关键词：孢子丝菌 总蛋白 双向电泳 差异蛋白 蛋白质组学 2 of Differentiallyexpressedproteinspathogenic in and rixschenckii yeastmycelial Sporoth phases Master candidate：Hou—Binbin degree Supervisor：ProfessorLiu—xiaoming Vice--supervisor：ProfessorLiu·-xiaoming