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微生物实验报告细菌的鞭毛染色及活细菌的运动性观察刘欣怡201100140057生命科学基地班组别：周一下午三组同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟实验时间：2012年10月号一、实验目的1.了解细菌鞭毛染色的原理，掌握鞭毛染色的方法。2.了解鞭毛的形态特征。3.学习用压滴法观察细菌的运动性。4.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术.二、实验器材菌种枯草芽孢杆菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，铜绿假单细胞菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。溶液和试剂硝酸银染色液、香柏油、二甲苯、95%的乙醇水溶液。仪器和其他用品酒精灯，载玻片，盖玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，小试管，烧杯，试管架，镊子、试管夹、吸水纸等。三、实验目的1、鞭毛是某些细菌表面细长弯曲的丝状物，是细菌的运动器官和特殊构造。细菌鞭毛的长短、数量和生长位置是鉴别菌种的一个重要的形态学指标，也是细菌重要的抗原物质与致病因素。根据鞭毛的特征，可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。2、鞭毛是细菌的纤细丝状运动“器官”。鞭毛的有无、数量及着生方式也是细菌分类的重要指标。鞭毛直径一般为10~30nm,只有用电镜才能直接观察到。若要用普通光学显微镜观察，必须使用鞭毛染色法。鞭毛染色的基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂附着在鞭毛上使其加粗，然后用碱性复红（Gray氏染色法）、碱性复品红（Leifson氏染色法）、硝酸银（West氏染色法）或结晶紫（Difo氏染色法）进行染色。本实验采用的是硝酸银染色法。3、枯草芽孢杆菌是鞭毛周生，而铜绿假单细胞菌是鞭毛端生。4、在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增加反差，若光线太强．细菌和周围的液体难以区分。进行悬滴法观察时，如经常难以找到样品，可在滴加液滴之后，用记号笔在液滴周围画一短线作为标记。观察时首先在低倍镜下对准记号线聚焦清楚后，再移动凹载玻片寻找液滴的位置。四、实验内容在本实验所提供的枯草芽孢杆菌和铜绿假单细胞菌中任选其中一种菌进行实验。本实验共两部分，第一部分是用压滴法观察活细菌的运动；第二部分是用硝酸银染色法观察细菌鞭毛的形态。五、实验步骤（一）压滴法观察活菌的运动1、涂片：将洗净的载玻片放置自然干燥后，用胶头滴管在载玻片中央滴一滴蒸馏水，注意水滴不要太大，滴好后放置在桌面上。在酒精灯火焰旁左手拿长有细菌的试管（斜面培养基），右手拔出试管塞，用已经在酒精灯火焰上烧灼过2遍的接种环伸入试管，在试管壁上稍稍冷却后，在菌落上蘸1到2下，取出接种环，稍稍在酒精灯上烧一下棉塞，然后塞入试管。将接种环上蘸取的细菌在载玻片上的水滴中蘸3到4下，可看到水滴略有浑浊。2、加盖玻片：如下图所示，向载玻片上放置盖玻片。然后向下缓缓放下盖玻片至盖玻片完全压在载玻片上，注意动作缓慢、轻巧不要产生气泡。3、观察：将做好的玻片放在显微镜上进行观察。操作通显微镜正确操作，调暗光，先低倍镜，再逐渐增大倍数。可以再玻片上用记号笔做一小记号，便于在显微镜视野中找到菌。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。（二）硝酸银染色法观察鞭毛1、洗片并净片：将载玻片用清水充分洗净，再置于95%乙醇中浸泡，5min后取出载玻片自然干燥。使用时用镊子取出，用试管夹夹着载玻片的一个小角，在火焰上来回移动，烧去乙醇及可能残留的油迹。2、涂片:在载玻片的一边上滴一滴蒸馏水(不要太大，也不要太小)，无菌操作同上用接种环蘸取一些菌，然后在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下，会看到水滴略微变混，将载玻片倾斜竖立，会看到菌液滴向下流出一条粗线（切勿涂抹），然后用吸水纸在竖立的载玻片下端吸去多余的菌液，注意不要吸去太多使得载玻片上菌太少而易使实验不成功.如下图所示：（液滴沿着竖立的玻片向下流）3、自然干燥：涂好的载玻片水平放置自然风干，至载玻片上的长条菌液痕迹全部干燥好，即细菌在载玻片上固定好4、用A液染色：在自然干燥好的载玻片上，用胶头滴管向载玻片滴加A液，让A液把菌都覆盖上，载玻片水平放置，染色3到5分钟，为了实验能成功，本次试验A液染色时间为5分钟。5、水洗： 将A液染色好的载玻片翻转过来，用较缓的小水流冲洗载玻片没有细菌的那一面，水洗至流出的水无色为止。6、用B液染色：水洗好的载玻片，不用干燥，直接用B液先冲洗，冲去多余的水分，然后让B液覆盖所有菌染色30秒到一分钟，染色过程中稍微加热一下，可以在酒精灯火焰上来回过3到4下。7、水洗： 将B液染色好的载