内毒素对原代大鼠肝星状细胞表达结缔组织生长因子影响机制探究.docVIP

内毒素对原代大鼠肝星状细胞表达结缔组织生长因子影响机制探究[摘要] 目的 研究内毒素（LPS）与其刺激的Kupffer细胞（KCs）培养上清（KCCM）及NF-κB通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对大鼠原代肝星状细胞（HSCs）表达结缔组织生长因子（CTGF）的影响，探讨LPS刺激HSCs表达CTGF的机制。 方法 分离培养原代大鼠HSCs、KCs。培养72 h的KCs经1 mg/L LPS刺激48 h后收集上清标记为KCCM1，未经LPS刺激的上清标记为KCCM0。将培养72 h的HSCs随机分为空白对照组、KCCM0组、LPS组、KCCM1组、PDTC组、（PDTC+LPS）组、（PDTC+KCCM1）组。各组HSCs经相应的处理48 h后，Western blot检测各组HSCs表达CTGF水平，ELISA检测培养上清中Ⅰ型胶原含量。 结果 各组HSCs中CTGF蛋白表达水平为：空白对照组（1.95±0.67）、KCCM0组（2.15±1.10）、LPS组（4.56±4.16）、KCCM1组（5.21±3.23）、PDTC组（0.06±0.02）、（PDTC+LPS）组（0.10±0.08）、（PDTC+KCCM1）组（2.77±4.08）。LPS与KCCM1作用于HSCs后CTGF表达增加（P 0.05）；PDTC几乎可以完全阻断正常及LPS剌激的HSCs表达CTGF（P 0.01），但只能降低KCCM1组CTGF的表达（P 0.05）；KCCM1组HSCs上清中Ⅰ型胶原的含量增加（P 0.05）。 结论 LPS可直接通过HSCs内的NF-κB通路使其表达CTGF水平上调，LPS刺激的KCs还可能通过其他途经使HSCs表达CTGF水平上调。 [关键词] 肝星状细胞；Kupffer细胞；肝纤维化；结缔组织生长因子；NF-κB [中图分类号] R575.202 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（b）-0015-03 肝星状细胞（HSCs）的活化是肝纤维化发生与发展的重要细胞学基础，也是肝纤维化研究的热点与核心内容之一[1-2]。临床及实验资料表明，肝病时常伴有的肠源性内毒素血症在肝纤维化的发生、发展中起重要作用，本实验室先前的在体动物实验显示，肝纤维化过程中内毒素（LPS）可增加结缔组织生长因子（CTGF）在肝内的表达，且很可能是通过激活NF-κB通路实现的[3-4]，但LPS是直接刺激HSCs，还是通过在体情况下的复杂的细胞神经体液机制而促进CTGF的表达尚不明确。本实验拟采用离体培养原代大鼠HSCs的研究技术，进一步阐明LPS刺激HSCs表达CTGF的机制。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠15只，清洁级，体重400～450 g，购自山西医科大学动物中心，普通饲料喂养，自由饮水。 1.2 方法 1.2.1 原代HSCs、KCs分离培养与鉴定 采用本研究室以往的方法[5]，KCs以RPMI 1640培养48 h后，免疫细胞化学SABC法鉴定其中溶菌酶的表达情况。原代培养HSCs 7 d后，以免疫细胞化学SABC法鉴定原代HSCs中Desmin及a-SMA的表达情况。 1.2.5 ELISA检测各组细胞上清中Ⅰ型胶原含量 按ELISA试剂盒说明书操作，终止反应后在酶标仪450 nm处测定并计算各组培养上清液中Ⅰ型胶原含量。 1.3 统计学方法 2 结果 3 讨论 肝脏在清除肠源性细菌、毒素的同时也遭受其攻击。LPS是革兰阴性杆菌细胞壁的重要结构成分，能加重肝脏的病理损伤，激活Kupffer细胞使其合成并释转化生长因子、血小板衍生生长因子、肿瘤坏死因子、干扰素等多种细胞因子，诱导HSCs基因表型改变并转化为肌成纤维母细胞，细胞外基质沉积增加，促进肝纤维化形成。KCs活化产生大量活性氧（ROS）诱导氧化应激也可以加重肝纤维化程度[6]。 Muhlbauer等[7]发现LPS可诱导HSCs表达NF-κB增加。未活化的HSCs中NF-κB由p65、p50亚基和ⅠκB形成的复合物存在于胞质并无活性，当细胞受到外界刺激时，ⅠκB蛋白离开复合物，p65进入细胞核内激活后移位至细胞核内，激活下游多种基因的转录与表达[8]。新分离的HSCs核内缺乏NF-κB，而活化的HSCs中NF-κB核转位活性，同时有基因的表达变化，表明NF-κB参与大鼠HSCs活化的调控。研究显示，NF-κB可调节KCs释放炎症介质，参与调控HSCs表型转换[9]。NF-κB在激活的HSCs中表达增多后可进一步激活其下游基因，可能通过诱导纤维化因子的基因表达来介导肝纤维化过程[10]。 肝