子生物学实验技术斑马鱼胚胎蛋白WB方案.docVIP

斑马鱼胚胎蛋白 ㈠ 使用液的配置： 1.蛋白提取液Lysis buffer）：0.6ml 1M Tris HCl PH 6.8 1.0ml 50% Glycerol（甘油） 2.0ml 10% SDS 6.4ml H2O 10 ml Lysis buffer -20℃分装保存备用 备注：Lysis buffer使用前需加入1：100的100mM PMSF。lycerol（甘油）Glycine（氨基乙酸） 10ml 10%SDS 加双蒸水至1000ml 4.转移缓冲液（Transfer buffer）： 3.0g Tris-base 14.4g Glycine（氨基乙酸） 200ml Methanol（甲醇） 加双蒸水至1000ml 5.封闭液(Blocking solution)：称5g脱脂奶粉溶于100ml TBST中。 6.洗涤液（TBST buffer）：20mM Tris-HCl pH 7.4 0.15M NaCl 1-5 ml 0.5% TWEEN-20 加双蒸水至1000ml ㈡ 斑马鱼胚胎蛋白的提取： 取100枚胚胎放入1.5ml EP管中，用灭菌水清洗2次，加入200μl Lysis buffer（预加1% PMSF），匀浆器匀浆，再加入300μl Lysis buffer，votex 1min；将处理后的样品放入沸水中煮8 min，12000g离心5 min，取上清，蛋白样品即位于上清中-80℃。（胚胎可以先冻存于-80℃，以后再提取蛋白，若胚胎数量少，而目的蛋白也少，则可以减少Lysis buffer的加入量。） 2. BCA法测定蛋白含量。见BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）说明书。 ㈢ Western blotting定量分析蛋白： SDS电泳： ⑴ 清洗玻璃板：用洗洁精清洗，再用纯净水冲洗干净，晾干。 ⑵ 灌胶与上样： ①. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上。（两侧的玻璃一定要对齐，否则漏胶。） ②. 制备分离胶(pH 8.8): 凝胶浓度的选择要依据蛋白分子量的大小而定，详细的方案见说明书； 按说明书配置凝胶液； 灌胶，可以用1ml 枪吸取1 ml凝胶沿玻璃缓慢加入到两层玻璃板中间，高度为6 cm左右，前面预留1.5 cm用于配置浓缩胶。凝胶上方加一层异丙醇或乙醇用于液封，这样可以让凝胶凝的更快。（灌胶时开始可以快一些，快到所需高度则要放慢速度。操作时要让胶沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）室温放置让胶凝固。 当水和胶中有一条折射线时，表明胶已凝固。再等3 min可用吸水纸将异丙醇或乙醇吸干。 ⑶．制备浓缩胶（pH 6.8）：4%浓缩胶配合小于10%的分离胶使用，6%浓缩胶配合大于10%的分离胶使用。 a．按说明书配置凝胶液； b．将剩余空间灌满浓缩胶，将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡。插梳子要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔上样体积减小，所以要在凝固过程中经常在两边补胶。待浓缩胶凝固后（约需30-60 min），分别捏住梳子两侧垂直向上轻轻拔出梳子。 c．用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板向外。若只跑一块胶，槽的另一边要加一块塑料板且有字的一面往外。） d．取提好的蛋白（一般不大于24μl），加入5xSDS上样缓冲液，加入1.5 ml EP管中沸水煮5 min使蛋白完全变性。 ⑷．电泳：恒压条件下，浓缩胶在80 V条件跑25-30 min；分离胶在120 V跑60-70 min。 2．转膜： ⑴ 准备工作： ① 配置转移缓冲液，需额外配置200 ml用于平衡凝胶和膜及润湿滤纸。 ② 从玻璃板上取下凝胶，切去浓缩胶，依据蛋白大小切目的蛋白凝胶（镊子取膜时要轻轻夹住Marker部位）。 ③ 将凝胶浸入转移缓冲液中15-30 min。 ④ 滤纸需在转移缓冲液中至少浸泡30 s。 ⑤ 依据凝胶大小裁剪适宜大小的PVDF膜： a．在