耐多药大肠埃菌质粒介导的耐药基因探讨.pdfVIP

目 录 1 耐多药大肠埃希菌质粒介导的耐药基因探讨………………1 1. 1 中文摘要………………………………………………………1 1.2 英文摘要………………………………………………………3 1.3 前言……………………………………………………………5 1.4 材料与方法……………………………………………………6 1. 5 结果……………………………………………………………11 1.6 讨论……………………………………………………………23 1.7 结论……………………………………………………………28 1.8 参考文献………………………………………………………29 1.9 英汉缩略词对照表……………………………………………33 2 致谢……………………………………………………………34 3 大肠埃希菌质粒介导的耐药机制研究进展（综述）………35 ４ 学习期间发表的论文复印件…………………………………49 耐多药大肠埃希菌质粒介导耐药基因的探讨 摘 要 目的 探讨泸州地区质粒介导的产 ESBLs (extended –sperectrum β-lactmases)耐多药大肠埃希菌TEM,SHV,CTX -M ,CTX-M-3,CTX-M-22 、 CTX-M-24 等６种耐药酶基因分布状况和对常见抗生素的耐药情况,为临 床治疗大肠埃希菌感染合理选用抗菌药物提供理论依据。方法 1.纸片扩 散法 （Kerby-Bauer 法，K-B 法）：采用美国全国临床检验标准委员会（the National Committee for clinical Laboratory Standards ，NCCLS ）推荐的该方 法测定 71 株大肠埃希菌对常见的氨基糖苷类，氟喹诺酮类, 第三代头孢 菌素类抗生素的耐药性。该实验方法要点：将接种于 M-H (酪蛋白琼脂) 平板上（37℃孵育24 小时）的待测细菌制备成与0.5 麦氏标准管浊度相同 的菌液，并把菌液均匀涂布于灭菌的Mueller-Hinton 培养基表面，数分钟 干燥后，用无菌镊将药敏纸片分别平贴于 M-H 培养基表面，每张纸片间 距离不少于25mm ，纸片中心距离平皿边缘不少于 15mm。将贴有纸片的 平皿于37℃孵育24 小时后，用毫米尺测量抑菌环直径，抑菌环的边缘以 肉眼见不到细菌明显生长为限，抑菌环直径的大小反映了测试细菌对测定 抗生素的敏感程度。大肠埃希菌菌标准菌株ATCC 25922 进行质控对照。 2.PCR 技术：采用质粒小提试剂盒制备质粒DNA 扩增模板；2×Taq PCR MasterMix ，6 种靶基因PCR 扩增体系均为：每一个PCR 反应体系共35ul, 其中模板7ul，引物1 对各5ul，２×Taq PCR MasterMix 15ul，ddH O 8ul 。 2 PCR 反应循环参数为：94℃预变性3min，94℃变性30 s，55℃退火30s， 72℃延伸30s，共30 个循环；循环结束后72℃再延伸5min 。PCR 产物进 行2%琼脂糖凝胶电泳，以标准菌株ATCC 25922 进行阴性对照。用紫外 线检测仪分析结果并用凝胶成像仪摄像；3. PCR 产物测序：PCR 产物进行 基因测序仪检测碱基序列，与已知的6 种基因序列相比较。结果 1.药敏 1 实验结果：临床分离的 71 株大肠埃希菌中，全敏 6 株 （8.57% ）；单耐 16 株 （22.86% ）；双耐19 株 （27.14% ）；耐多药30 株 （42.86% ）。2. 耐多药单酶基因检测结果：TEM 有11 株（36.67% ）；SHV 仅 1 株（3.33% ）， 所占比例较低；CTX-M 有23 株 （76.67% ）；CTX-M-3 有21 株 （70% ）， CTX-M-22 有错误!未找到引用源。 9 株 （12.86%）；CTX-M-24 有错误! 未找到引用源。24 株 （80%）。３.耐多药多酶基因检测结果：含2 种酶 基因同时检出的有 30