体外培养骨髓间充质干细胞对小肠上皮细胞IEC-6增殖的作用.pdfVIP

体外培养骨髓问充质干细胞对小肠上皮细胞IEC-6增殖的影响 体外培养骨髓间充质干细胞对小肠上皮 细胞IEC．6增殖的影响 专 业：内科学 硕士研究生：石柳 导 师：陈其奎教授 中山大学曜属第二医院消化内科 中文摘要 小肠是人体重要的消化吸收器官，多种因素致小肠组织结构损伤和功能障 碍等，小肠黏膜损伤修复的机制不明，因而在治疗上未能取得满意的效果。研究 发现，小肠隐窝处存在着小肠上皮干细胞，它可以分化为吸收细胞、杯状细胞、 肠内分泌细胞、潘氏细胞等小肠上皮细胞，在上皮细胞正常的衰老死亡和病理损 伤后，干细胞增殖、分化，在上皮修复过程中发挥主导作用。小肠上皮干细胞的 增殖、分化行为受细胞基因及干细胞所处的微环境双重因素影响，生长因子、细 胞因子和细胞基质分子形成的微环境提供了干细胞增殖与分化的必要的物质基 进肠上皮细胞的增殖。 新近的研究发现，小肠黏膜损伤后，除了小肠本身具有强大的自我更新及 损伤修复能力外，一些肠外来源的细胞如骨髓的细胞等也参与了其中的调节。将 stemcells，MSCs)移植入器官损伤的动物体 骨髓间充质干细胞(mesenchymal 内，可见损伤的器官内有外源的细胞定植，MSCs可向多种组织器官迁移定位并 分化为相应的组织细胞，参与损伤组织器官的修复。MSCs起源于中胚层，具有 多向分化的潜能，MSCs可以分泌大量的促进细胞增殖分化的因子，如肝细胞生 长因子、神经细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等。目前，体内研究表明骨 髓MSCs能向受损的小肠粘膜迁移、定植、分化，分泌细胞因子，促进隐窝再生， 并与小肠上皮干细胞相互作用，加速受损粘膜修复。 体外培养骨髓间充质干细胞对小肠上皮细胞IEC-6增殖的影响 本实验主要从体外研究MSCs对损伤小肠上皮细胞的修复作用。分为三部 分，第一部分：采用全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠的MSCs，为体外 共培养研究做准备；第二部分：大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC-6的鉴定及体外放 射损伤模型的建立；第三部分：利用Transwell间接接触共培养装置进行研究， 观察MSCs对正常及放射损伤IEC-6的影响。 研究目的： l、探讨通过全骨链培养体外扩增培养大鼠MSCs的方法。 2、鉴定大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6，建立放射损伤IEC石细胞模型。 3、观察体外培养骨髓间充质干细胞对正常及放射损伤小肠隐窝上皮细胞 IEC．6凋亡与增殖的影响，探讨MSCs参与小肠隐窝上皮细胞损伤修复的作用机 制，为MSCs治疗损伤小肠提供实验依据。 研究内容及方法： l、全骨髓培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs) 取3--4周龄雄性SD大鼠，冲出股骨及胫骨骨髓腔内细胞，吹打成单细胞悬 液，离心收集细胞，用含10％胎牛血清的完全培养基培养并传代扩增。流式细胞 仪检测荧光标记的表面标志CD29、CD44、CD34、CD45。 2、大鼠小肠隐窝上皮细胞株IEC．6的鉴定及放射损伤模型的建立 应用免疫细胞化学双染色，鉴定lEC-6中肠干细胞蛋白水平的表达；行 8Gy、10Gy、12Gyl3射线，光镜下观察形态学变化，流式细胞仪检测凋亡率，选 择合适剂量，建立放射损伤细胞模型，及观察时间，为MSCs修复提供实验基础。 3、共培养研究 U 体外培养骨髓间充质于细胞对小肠上皮细胞IEC-6增殖的影响 变化。 实验结果： l、接种后2d后首次换液，贴壁细胞呈现多角形、梭形、纺锤形等，第10d 逐步形成细胞克隆。12d-～16d后细胞融合成单层，达80％--90％，传代后的细胞 较原代贴壁、生长快速。随代数增加，细胞形态趋向均一，呈梭形为主，细胞克 隆呈“漩涡状”。FCM检测结果显示细胞均一性好，阳性率：CD2999．17=1=1．36％， CD4498．24+1．01％，CD342．79士0．24％，CD451．69