体外构建组织工程学骨软骨复合组织修复兔关节软骨缺损的探究.pdfVIP

体外构建组织工程学骨／软骨复合组织 修复兔关节软骨缺损的研究 硕士生姓名：王 斌 指导教师：郑连杰教授 指导小组：杨 梁副教授 专业名称：外科学 摘 要 目的：利用骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养、增殖、诱导分化 为软骨细胞和成骨细胞，移植于同种异体骨制备的“双向骨基质明胶 (BMG)上，构建组织工程学骨／软骨复合物，探讨其修复关节软骨缺损的 可行性及效果。 方法：2．3月龄日本大耳兔36只，体重2．5．3．5kg，雌雄不限。 体外实验：①骨髓间充质干细胞的提取、诱导：取30只实验兔，无 菌条件下骨髓穿刺针取股骨骨髓，采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分 离纯化骨髓间充质干细胞，在特定的软骨诱导剂(HG．DMEM、地塞米 l％)、成骨诱 松0．1itmol／L，维生素C50mg／L，TGF-p110ng／L，ITS．3146 导剂(15％FBS、LG．DMEM、地塞米松0．19mol／L，维生素C50mg／L，D． 甘油磷酸钠l0mmol／L)的定向诱导下，向软骨细胞和成骨细胞分化。② 支架载体：取实验兔6只，处死后取股骨内外髁及胫骨上端骨柱，制备 一侧全脱钙，一侧未脱钙的“双相”骨基质明胶支架载体。③骨／软骨复合 物的制备：将诱导后具有成骨细胞和软骨细胞相应表型的MSC分别移植 到事先处理好的“双相”骨基质明胶支架载体上，脱钙侧移植软骨细胞； 未脱钙侧移植成骨细胞继续培养，分别在1w，2w，3w行甲苯胺蓝染色、 茜素红染色、碱性磷酸酶(ALP)染色，II型胶原蛋白免疫组化染色。 体内实验：骨／软骨复合物的动物体内试验、检测：将抽取骨髓的30 只实验兔，制成双侧股骨膝关节面骨／软骨缺损模型，左右双膝共4个缺 损，单侧关节面共上下两个相同缺损。实验兔右膝：将造模时取出的左 膝自体骨／软骨组织植入实验兔的股骨髌后上端软骨缺损(A组)，制备的自 体MSC组织工程骨／软骨复合物植入右侧下端缺损(B组)：左膝上端缺损 植入空白支架(C组)，下端缺损不予处理(D组：对照组)；分别于术后4、 8和l2周取材。行大体观察：茜素红染色、甲苯胺蓝染色：免疫组化检测： 法评分，比较各组修复效果差异。 统计方法：采用SPSS11．5统计软件包进行分析，数据以均数±标准 差表示，组间比较采用方差分析，P0．05为有统计学意义。 结果：体外实验：通过茜素红染色、甲苯胺蓝染色、碱性磷酸酶(ALP) 染色、II型胶原蛋白免疫组化染色证实，MSC作为种子细胞，可以分化 成软骨细胞和成骨细胞。经甲苯胺蓝染色显示，分化诱导的成骨细胞和 软骨细胞在支架上可以成活及增殖；II型胶原蛋白免疫组化染色显示， 支架一端细胞核蓝染，另一端棕褐色，说明成功构建骨／软骨复合组织。 体内实验：大体观察及茜素红染色、甲苯胺蓝染色、碱性磷酸酶 (ALP)染色、Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色检测显示：A组：术后4w基 本完全修复，与周围组织无明显界限，按压修复组织弹性好：l2w完全 修复缺损，与周围组织很难区分。B组：术后4w软骨缺损基本修复，表 面光滑，有弹性：12w按压缺损部位弹性类似正常关节软骨，表面光滑， 色泽基本一致，无明显界限，与A组无明显区别。C组：术后4w可见 损处新生组织表面不规则，与周围软骨界限明显，镊子按压时略有弹性，但 弱于正常关节软骨：l2w可见缺损处光滑，按压有弹性，与周围组织弹 性有差别，颜色不一致，略凹陷。D组：未能修复，关节软骨缺损低于 周围软骨组织，未见软骨样组织，按压较硬，无弹性。 改良Wakitani法评分结果显示，在各时间段的检测，A组、B组各 项评分结果，优于C组、D组，P0．01有统计学意义。II型胶原蛋白免 疫组化染色结果显示，A组、B组修复组织中的软骨细胞阳性率明显高 于C组、D组，P0．01有统计学意义。 结论： 1．骨髓间充质干细胞诱导分化的软骨、成骨细胞可以在“双向”骨 基质明胶上增殖。 2．同种自体骨／软骨复合物可以修复关节软骨缺损。 3．在同一“双向骨基质明胶上两种细胞构建的组织工程学骨／软骨 复合组织，可以解决软骨