M-%2c2-受体抗体在肺心病发病中对心脏功能影响地实验研究.pdfVIP

山西医科大学硕士学位论文 改变和M2受体自身体抗体对离体大鼠灌流心脏的影响，来酏【!J_|M2受体抗体在肺心病发 病过程中对心脏功能的影l』向。我们的研究可以进一步说明在川-心病发病中是否都有免疫因 素的参与，如何参与了对心脏功能的调节，以及M2受体抗体对心脏功能作用的机制。希 望我们的研究能为阻止肺心病的发生、发展以及治疗提供帮助。 材料和方法 1材料： 1．1实验动物： 健康雄性Wistar大鼠(由山西医科大学生理教研室所属动物房提供)20只，体重 200．3009，饲料为标准块料，饲养在18—20。C的动物房内，自由摄食饮水。 1．2材料与仪器： M2受体抗原肽段的合成：按照人M2．胆碱能受体细胞外第二环功能表位肽段序列 S (169～193位氨基酸残基，V-R—T-V．E．D．G．E．c．Y．I—Q．F…FN．A．A．v．T．F．G．T-A．I．C)，由 武汉生物化学研究所合成。缺氧舱(体积220升)，参照薛氏方法㈣制作，CYS．1数字式 碱受体激动剂卡巴克(Carb，Sigma)，M胆碱受体阻断剂阿托品等。 2方法： 2．1将20只wistar大鼠随机分为以下2组： 对照组：lO只，无缺氧，正常饲养，共6周。 单纯缺氧组：10只，参照薛氏方法【281，将大鼠置于缺氧舱(体积220升)内，向舱 内注入氮气，用CYS．1数字式测氧仪测量舱内氧分压，半小时内使氧分压降至(10-F0．5) ％，之后通入氧气维持该氧分压，舱内二氧化碳和水蒸气用钠石灰(辽宁沈阳医药股份有 限公司化玻公司)和无水氯化钙(天津市巨星圣源化学试剂有限公司)吸收，舱门等处留 有小缝维持常压，每天缺氧8小时，每周6天，共6周。 2．2M2受体抗体的测定： 2．2．1采血及血清的提取： 实验前及实验开始后每周一次，经尾静脉断尾采血，静置待析出血清后提取，每管 50u1分装，～80℃保存。 2．2．2 配成浓度为lmg／ml的抗原包被液，包被于微量滴定板，4℃吸附18小时。 ②加入PMT溶液：磷酸盐缓冲液中加入5％小牛血清、0．1％吐温--20、O．1％硫柳汞， 37℃水浴1小时，封闭滴定板。 ③血清标本从l：20开始用PMT倍比稀释，作终点滴定，37。C水浴l小时。 山西医科大学磺士学位论文 ④加l：1000生物索化羊抗人lgG单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司提供)， 37℃水浴1小时。 ⑤加入l：800辣根酶标记链亲和素(HRP．SA北京中山生物技术有限公司提供)，37 ℃水浴1小时。 液中，临加样前加入H202(25retool／L)，37。C水浴30分钟。 (OD)。 u 以上步骤每孔加样50l，①～⑤每步终了时用PBS一吐温．20沈涤3次，每次5分钟。 2．23SA-ELISA数据分析： P／N值≥2．1为阳性，P／N值≤1．5为阴性。 ②抗体效价判定：将血清标本从1：20起连续倍比稀释，以出现P／N值／-2．1的最高 稀释度作为该标本的效价。 2．3肺动脉压测定： 采用孙氏法{29】，三通管一端连导管，一端连压力感受装置，另一端连充有肝素的注 射器，经右侧颈外静脉插管，入右心室及肺动脉，根据监视器所示记录肺动脉压力值和压 力曲线。 2．4心脏解剖测量心脏大体标本： 用5％的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(O．6ml／1009)后，颈动脉放血处死动物，迅速 取出心脏，用生理盐水清洗后，去掉心房组织，沿室间隔边缘将右心室切下，分别称重右 室(R)，左室加室间隔(L+S)重量，以及计算右室／左室+室间隔【R／(¨s)】重量比， 右室／体重比(R／BW)，左室加室间隔／体重比[(L+S)mw]。 2．5M2受体抗体纯化： 效价经SA．ELISA检测，获取抗M2受体抗血清。为了减少血清中其他成分对试验的 非特异影响，我们Mab Kit试验盒对高效价(兰l：160)抗血清进行亲和纯化，纯化 Trap 2．6离体灌流心脏心功能的测定： 2．61台氏液(IllmOl／L)溶液配制： NaCI135，