Egr-1特异脱氧核酶对大鼠血管平滑肌细胞层粘连蛋白表达地影响.pdfVIP

·论文· Egr-1特异脱氧核酶对大鼠血管平滑肌细胞层粘连蛋 白表达的影响 刖 罱 tervention，PCI) 大量研究表明，冠状动脉介入治疗(percutaneouscoronary 术后再狭窄(restenosis，RS)的发生是一个多因子参与的复杂病理过程，其中 包括血管弹性回缩、血小板粘附聚集及血栓形成、新生内膜形成等多个环节。 其中主要机制是血管损伤局部中膜，平滑肌细胞过度增殖，向内膜迁移及细 胞外基质(extracellularmatrix，ECM)形成引起的内膜增生【ll。因此寻找有效 的手段抑制平滑肌细胞增殖、迁移对临床预防再狭窄具有重要的指导意义。 片段，可催化剪切特异的RNAt2，31，其序列中间为保守的催化活性区，据两侧 的特异识别序列识别底物RNA，将底物RNA切断，从而调控蛋白质的表达。 早期生长反应因子一1(earlygrowthresponsefator，Egr-1)是一种即刻早期基 factors，TF)，也是一种DNA结合 因产物和锌指结构转录因子(transcription 蛋白，可以与富含GC的序列结合而调节转录。血管机械损伤后Egt-1快速上 调其表达【4l，调控着多种与细胞增殖相关基因的表达f5’61，从而诱导血管平滑肌 smoothmuscle 细胞(Vascular cells，VSMC)的分裂、增殖和内膜增生，因此 与细胞增殖关系密切171。ECM是新生内膜的主要成分及参与重塑的主要元素， 可调节平滑肌细胞的增殖、迁移，是参与术后再狭窄的主要物质。层粘连蛋 主要存在于基膜和血管平滑肌周围，由内皮细胞和平滑肌细胞分泌，LN还能 促进血管上皮细胞的增殖与修复，当血管出现病变时，细胞外基质中LN含量 对大鼠胸主动脉平滑肌细胞Egr．1和LN表达的影响。 4 实验材料与方法 一、实验材料 1、实验细胞：人鼠Alo丰动脉甲滑肌细胞株(购自上海轩力生物科技有限 公司，原代从美国ATCC细胞库引进)。 2、主要试齐0：胎牛血清(杭州四季青公司)、高糖DMEM、胰蛋白酶 限公司)、琼脂糖(卜海，#物有限公司)。 二、实验方法 1、培养大鼠AIOE动脉平滑肌细胞 主动脉平滑肌细胞，用025％胰酶消化、传代。 l I 图1，人越A10i动J脉1’卅肌细胞(×100 2、分f_|I 后瞬时转染ED5。 3、稳定转染VSMC 鉴定。 使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。 细胞转染Egr．1及稳定转染克隆的筛选：当VSMC在6孔板内达到60％融合 时进行转染。具体操作按FuGENE6说明书建议的操作步骤进行。细胞转染24h 2周以后，将稳定转染的克隆挑入96孔板中并扩增。 4、ED5的序列设计及合成 体外培养的大鼠平滑肌细胞。ED5碱基序列为： 部分为寡核苷酸识别序列。在其3’端进行硫代修饰，经聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (PACE)纯化，冻干保存。 5、寡核苷酸(0DN)的转染 操作步骤严格按转染费0JFuGENE6使用说明书进行：将细胞计数铺板在不含抗 汇合后更换无血清无抗生素DMEM培养基培养30h。转染当日，在1．5ml无菌 Eppendorf中 比例加入ED5、并混匀，室温孵育15min。以0．1pmol／浓度将混合液逐滴加入上述 细胞中，进行平滑肌细胞的基因转染，18h后更换含10％FCS无抗生素的DMEM进 行二次转染，继续培养细胞24h，用于以后的相关检测。 6 (1)采用Trizol试剂一步法提取大鼠VSMC总RNA 试剂于培养瓶中，用枪头反复吹打贴壁的细胞，保证细胞全部裂解，