RyR2-Ca2%2b释放对小鼠心肌细胞SK通道功能地调节.pdfVIP

摘要 (P0．01)。 为38．4a：6．6 TG+apamin组的APD50和APD90均无显著改变(PO．05)。 6．给予小鼠心房肌细胞局部场刺激，心房肌细胞产生钙瞬变，其增加的峰值 约1．13士0．29(F／Fo)(n_8)。预先加入20 lxM的ryanodine，给予心房肌细胞局 45 预先加入2州的TGmin后，给予心肌细胞局部场电刺激，钙瞬变的峰值约 为0．34a：0．21(F／Fo)(1l-10)，显著低于对照组(PO．01)。 小结 1．SK2通道参与心肌细胞动作电位复极化的构成，阻断SK2通道使动作电 位复极化明显延长。 RyR2．Ca2+释放均使动作电位复极化明显延长。 3．Ryanodine或TG可明显抑制细胞内钙瞬变幅度。 实验结论 放有着密切的关系。 关键词：RyRs；sK通道；动作电位；钙瞬变；心肌细胞 第二部分：蛐一s诹NA对小鼠心肌细胞动作电位的影响 研究方法 1．新生小鼠心肌细胞的培养：将新生小鼠心脏取出，剪碎，胶原蛋白酶和 胰蛋白酶消化，差速贴壁法纯化心肌细胞。 Ⅳ 万方数据 摘要 基因的不同位点设计并合成4对shRNA片段，将其插入慢病毒载体 I和EcoRI酶切位点。测序鉴定后，分别命名为 psiHW-U6．EGFP的BamH 得慢病毒分别命名为Lenti—siRyR2．1~4。利用慢病毒及对照病毒感染小鼠心肌细 胞，48h后于倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(EGFP)表达，流式细胞仪 检测EGFP阳性细胞百分比。 mRNA水平：慢病毒感染48h 3．荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测RyR2 mRNA 后，提取细胞总RNA，检测RNA的完整性，进行逆转录反应，进行RyR2 的相对定量分析； 4．采用改良Langendorff灌流装置分离成年小鼠心房肌细胞：健康成年 C57BL／6J小鼠，雌雄不拘，抗凝及麻醉处理后取出心脏，低钙酶消化液及KB 液灌流后分离心房，制备心房肌细胞悬液。 5．重组慢病毒载体感染成年小鼠心房肌细胞：将成年小鼠心房肌细胞置于 含胎牛血清的培养基中培养lh后，再用不含胎牛血清的培养基换液，加入慢病 毒继续培养48h。 6．Western blot检测：原代培养成年小鼠心房肌细胞，慢病毒感染48h后提 取蛋白，经蛋白电泳和转膜后，依次加入一抗、二抗孵育，ECL法显影并进行 图像分析。 7．全细胞膜片钳技术记录成年小鼠心肌细胞的动作电位：拉制玻璃微电极 并充灌电极内液，选取有绿色荧光的心房肌细胞进行封接，电流钳模式下记录 空白对照组：心肌细胞无任何处理；(2)阴性对照组：scramblesiRNA感染心肌 其次观察了SK2通道抑制剂对动作电位的影响，实验分为3组：(1)apamin组： 空白对照组中，加入500 pM的apamin后继续进行动作电位的记录；(2)阴性 apamin后继续进行动作电位的记 对照+apamin组：阴性对照组中，加入500pM 录；(3)siRyR2+apamin组：siRyR2组中，加入500pMapamin后继续进行动作 组)apamin敏感的APD50和APD90。 N 万方数据 摘要 8．采用激光共聚焦钙成像技术观察成年小鼠心房肌细胞钙