叶酸干预对神经管畸形鼠Pax3基因和H3K27me3 的作用研究.pdf

Ningxia Medical University Thesis for Application of Master’s Degree Study About the Intervention Effect of Folic Acid on Pax3 and H3k27me3 in NTDs Rats Student’s Name : Zhou Changcheng Supervisor： Du Yong Subject Category: Medicine Major: External Medicine Specialty: Congenital Neural Tube Defects School: Clinical Medical College Completion Date: Mar. 2015 万方数据 万方数据 叶酸干预对神经管畸形鼠Pax3 基因及H3K27me3 的作用研究 摘 要 目的 构建全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA) 诱导的神经管畸形鼠模型， 了解神经管畸形(neural tube defects, NTDs)形成过程中Pax3 基因表达及H3K27 三甲基 化状态的情况，明确叶酸干预对这一现象的影响，探讨叶酸干预对神经管畸形的预防作 用及可能的发生机制，为神经管畸形的早期诊疗提供可靠的理论依据。 方法 1. 动物模型的建立：将 18 只性成熟健康雌性SD 大鼠随机均分为3 组：正 常组、畸形组、叶酸干预组。其中，叶酸干预组于孕前2 周喂食叶酸添加饲料（60 μg/kg ）， 直至终止妊娠；畸形组、叶酸干预组于E10d 时给予ATRA 100mg/kg 一次性灌胃，正常 组给予相同剂量橄榄油。 2. 形态学观察：E15d 剖宫取胎，对胎鼠进行形态学观察，记录胚胎总数、活胎数、 死胎数、吸收胎数、畸形胎数、正常胎数，统计并分析伴发畸形率。 3. 病理学观察：胚胎固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、常规切片、 HE 染色，显微镜下观察各组胚胎病理学改变并摄影。 4. 血清叶酸、同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy ）的测定：孕鼠腹部麻醉，胸部常 规消毒，心脏穿刺采血于离心管静止 30min 后，以 3000rpm 离心，取上清。以磷酸盐 缓冲液10：1 稀释，分装至100l 离心管上机检测。 5. Pax3 基因表达量的测定：运用Western bloting 技术和QRT-PCR 技术对各组胚胎 组织Pax3 基因表达量进行定量分析。 6. H3K27me3 表达的检测：运用免疫组织化学技术和Western bloting 技术对各组胚 胎组织H3K27me3 表达量进行定性、定量分析。 结果 1. 胎鼠畸形率统计显示正常组胎鼠未见畸形，畸形组神经管畸形的发生率 98.61%，叶酸干预组35.09% 。其中，正常组胎鼠总数为61 只，活胎60 只，死胎1 只， 正常胎61 只，未见吸收胎及畸形胎。畸形组总数72 只，活胎72 只，畸形胎71，其中 包括吸收胎2 只，正常胎1 只。叶酸干预组总数57 只，活胎57 只，正常胎37 只，畸 IV 万方数据 形胎20 只，未见吸收胎； 2. 病理学观察可发现正常组胎鼠发育正常，组织结构层次清晰。畸形组显性脊柱 裂胎鼠背侧皮肤及皮