吲哚美辛逆转人肺癌A549DDP细胞耐药作用和机制的研究.pdf

·中文论著摘要· 吲哚美辛逆转人肺癌A549／DDP细胞耐药的作用及机 制的研究 刖 罱 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年增加的趋势，目前缺乏有效 的治疗方法，如何改善肺癌的治疗状况、提高肺癌患者总的生存率是函待解决的 重要问题。在肺癌的综合治疗中，化疗是最基本的治疗方法，也是不可缺少的重 要手段。以顺铂等铂类药物为基础的联合化疗明显改善了晚期肺癌患者的治疗效 果，成为肺癌治疗史上一座新的里程碑，但其毒副作用较大且易产生耐药性，严 重影响其化疗效果。P．印是mdrl基因编码的ABC家族的一种ATP结合膜蛋白， 利用水解ATP释放的能量，逆浓度梯度将药物主动运输到细胞外，导致药物在细胞 内蓄积减少而产生耐药。livin是一种新的抗凋亡基因，有学者发现livin是参与肺 癌对放疗、化疗耐受的重要因素，在肺癌药物化疗后livin在肺癌组织中表达明显 一，它具有一定抗肿瘤作用，近年来有些学者发现IN与化疗药物合用，能增强化疗 药物对耐药肿瘤细胞的毒性作用。本研究应用IN和DDP联合干预A549／DDP细 胞，观察其对A549／DDP细胞增殖、凋亡、P．印蛋白，Livin蛋白表达的影响，探 讨其逆转A549／DDP细胞耐药的机制。 材料与方法 一、A549、A549／DDP细胞的培养 胰蛋白酶消化传代，每天换液一次，每2—3天传一次代。A549／DDP的培养基 中加入3肛gmlo的顺铂以维持其耐药性。 二、裸鼠A549／DDP移植瘤模型的制作 当A549／DDP细胞进入对数生长期后，采用不含DDP的培养液继续传代两次 后，消化、收集对数生长期细胞，细胞计数，调节细胞浓度为7．8x106／ml。常规 消毒裸鼠右前肢腋下皮肤，每只裸鼠皮下注射0．1ml细胞悬液，细胞数7x106，裸鼠 接种后待肿瘤最长径达1．0cm左右，取28只裸鼠随机分为4组。实验分组为对照组， 1．5mglN组、3．0mglN组、2．01ttgml’1DDP组。 三、噻唑蓝比色法测定(MTT) A549／DDP的抑制效应，求出IN对A549／DDP耐药逆转倍数。 四、免疫细胞化学法 细胞系经固定、封闭后，与Livin抗体孵育过夜。随后滴3JH--抗，DAB显色， 苏木素轻度复染核。 五、FCM AnnexinV／FITC、PI双染法 对数生长期细胞，以1．25x105／mL密度接种于培养瓶中，24h后，分成4组， 加meXinvFITC／PI试剂盒说明，流式细胞仪检测A549／DDP细胞凋亡。 六、Hoechsot33258染色法检测IN+DDP诱导凋亡 荧光显微镜激发波长350nm发射波长460nm下检测凋亡细胞。 七、JC．1线粒体跨膜电位检测 工作液将细胞沉淀均匀悬浮，用流式细胞仪分析。 2 八、caspase3活性检测 解细胞，提取蛋白加入检测试剂，用酶联反应仪测定A405波长。 九、WesternBlot与RT-PCR 应用Western livin基因、P·gP蛋白、Livin蛋白的表达情况。 转效率 A549／DDP细胞及裸鼠移植瘤在DDP联合应用IN的情况下，细胞及肿瘤组织 对99Tcm-MIBI摄取率的改变情况，评价P-gp蛋白的功能。 十一、统计分析 forwindow 各组资料利用SPSS 13．0进行统计分析。P0．05有统计学意义。 结 果 一、MTT比色法结果 玳可明显抑制体外培养的A549株和A549／DDP株细胞的增殖，且抑制程度 Iq-8001．tmol 随IN作用时间和浓度的增加而增加，呈一定的时间、剂量(20I．tmol 1-1) 依赖性，表明烈本身有细胞毒性作用，能抑制肺腺癌细胞的增殖；低于或等于 1001maol lJ确 l-