产酶海洋微生物的筛选.docVIP

产酶海洋微生物的筛选 前言：浩瀚的海洋是地球生命的摇篮，它覆盖着地球表面积的71%，海水总体积占地球总水量的97%。全球80％以上的物种蕴藏于海洋中，由于独特的生存环境（如高压、高渗、高温、低温等复杂多变的生态环境）及海洋生物物种间的生态作用远比陆生物种复杂和广泛，因此赋予海洋生物均活性远比陆生生物要强，尤其重要的是有些海洋生物活性物质的结构与陆生生物化合物不同，表现出独特的活性，作为产酶资源就具有了突出的特点和优势。人们从海洋环境中已经分离的到各种极端酶，如嗜冷酶、嗜热酶、嗜压酶、嗜盐酶等，由于具有广泛的适应性，在生物技术和工业应用中已担任了重要的角色。 1 材料与方法 样品采集 从连云港海域采集 培养基 细菌培养基 蛋白胨5g， 酵母粉1g， 琼脂20g 陈海水1000ml， pH 7.4-7.6 细菌富集培养基 将1.2.1的细菌培养基去掉琼脂 产淀粉酶细菌筛选培养基（初筛） 将1.2.1的细菌培养基加入2%的可溶性淀粉 产右旋糖酐酶的细菌筛选培养基（初筛） 将1.2.1的细菌培养基加入1%的右旋糖酐 产淀粉酶发酵培养基（复筛） 将1.2.1.2的培养基去掉琼脂 放线菌培养基 可溶性淀粉2， NaCl 0.5MgSO4?H2O 0.5 g, KNO3 1 g， K2HPO4 0.5g，FeSO4 0.01 g，琼脂 2 ，陈海水。重铬酸钾80mg?/L陈葡萄糖，琼脂 2陈。青霉素50mg?/L，链霉素50mg?/L取支25mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同糖的反应液。管 号 糖标准液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 糖含量 （mg） 0 0 2 0 1 0.2 1.8 2.0 0.2 2 0.4 1.6 2.0 0.4 3 0.6 1.4 2.0 0.6 4 0.8 1.2 2.0 0.8 5 1.0 1.0 2.0 1.0 6 1.2 0.8 2.0 1.2 摇匀，沸水浴min，取出，冷却，mL，混匀调波长50nm，用0号管调零点以光密度值为纵坐标，糖含量（mg）为横坐标，做标准曲线。 管 号 （mL） mL） 样品空白 1.0 1.0 样品 1.0 1.0 将样品于25℃水浴反应30min(样品空白不参加水浴反应)，然后将样品空白和样品每管加入2mlDNS试剂，沸水浴反应10min，冷却，各加蒸馏水10ml，混匀，测520nm处的吸光值，从标准曲线上查出麦芽糖的含量。 酶活力单位定义 在一定条件（25℃ 30min）下，1min催化产生1(g麦芽糖的酶量，即为一个酶活力单位。 菌株的初步鉴定 菌株的形态特征 观察菌落形态和大小，对细菌进行特殊结构染色，并进行显微摄影。 细菌的生理生化特性 接种：用接种环从斜面上挑取透明圈最大的菌株接种于安培瓶中。25℃培养。 序号 品名结果判断 培养时间 阳性 阴性 红色 黄色 24～48 M002 蛋白胨水(色氨酸肉汤) 红色环 黄色 18～24 - 氨基酸脱羧酶系列 对照 黄色 对照 黄色 18～24 试验 紫色 试验 黄色 - 糖醇类 指示剂 溴甲酚紫 黄色 紫灰色或紫色 18～24 溴麝香草酚蓝 黄色 绿色或蓝色 - 嗜盐性试验用胰胨水系列 浑浊 澄清 24 M032 硝酸盐肉汤 红色 不变色 ﹤1min M050 氧化酶试纸 紫色 无色 24 表3 细菌微量生化鉴定管的使用 注：培养结束后，添加相应的试剂，观察判断结果。 NaCl浓度对细菌生长的影响 配制NaCl浓度（%）分别为0,1.5，3.0，4.5，6.0，7.5，10的2216E液体培养基（蒸馏水配制）各两只，并留一只不接种作为对照，一支接种不培养作为初始浓度对照。分装于试管中，装液量为5ml,121℃灭菌20min。 在不同浓度NaCl培养基中以4％接种量接入菌悬液，25℃，180rpm，培养24h。 2. 结果与讨论 2.1菌落特征 表4 菌落特点 菌落 特征描写 大小 形态 干湿 高度 透明度 颜色 边缘 细菌 酵母菌 放线菌 霉菌 菌株的产酶特性 对透明圈进行描述，并拍照。 NaCl浓度对细菌生长的影响 以为纵坐标，（）为横坐标序号 品名结果判断 阳性 阴性 M002 蛋白胨水(色氨酸肉汤) - 氨基酸脱羧酶系列 对照 对照 试验 试验 - 糖醇类 指示剂 溴甲酚紫 溴麝香草酚蓝 - 嗜盐性试验用胰胨水系列 M032 硝酸盐肉汤 M050 氧化酶试纸 表6 生理生化性质鉴定结果