异基因外周血造血干细胞移植后供受者血细胞嵌合状态的临床探究.pdfVIP

摘 要 异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT) 后患者供体细胞嵌合状态的动态监测，可用于判断移植成功、移植物抗宿主病(graft versus host diseases ，GVHD)发生以及疾病复发、移植物被排斥，并指导临床早期实施相 应干预治疗。短串联重复序列 (short tandem repeats STR)是DNA 中特异序列重复串联排 列而成，具有高度的多态性。聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR ）扩增后可 以进行精确的个体识别，所以荧光标记的多重PCR 扩增STR 位点结合全自动毛细管电 泳方法，是嵌合状态检测中最灵敏的方法。进行 STR-PCR 的定量检测，可以准确测定 供受者细胞的嵌合率，评估供者细胞的植入状态，为临床allo-HSCT 后续治疗提供理论 依据。 本研究拟建立采用免疫磁珠分选技术（magnetic cell separation technique MACS ）， 利用 STR-PCR 结合全自动毛细管电泳技术，动态检测移植后各血细胞的嵌合状态，研 究其与供者细胞植入、造血恢复、移植物被排斥、疾病复发和 GVHD 之间的关系，从 而指导合理使用免疫干预治疗，提高移植成功率。 第一部分 STR-PCR 定量检测allo-HSCT 后供者细胞植入技术的建立 【目的】建立STR-PCR 定量检测方法。 【方法】取人类白细胞抗原（human leukocyte antigen HLA ）不同2 例正常人分别 作为供者和受者，按不同比例将供受者抗凝血混合，制成人工模拟混合嵌合(mixed chimerism，MC)样本，分别提取基因组DNA 后，进行PCR 扩增荧光标记的STR，同步 扩增 15 个STR 位点和 1 个性别位点，行全自动毛细管电泳及片段分析，根据DNA 片 段长度及等位基因梯（Ladder ）阅读各位点的基因型，选择嵌合率计算公式，得到供受 者细胞嵌合比例。 【结果】采集5 对供受者外周血或骨髓，进行位点检测。5 例移植后均可检出供者 的特异性STR 位点，最小检出的供者细胞嵌合百分比达1～2% 。 在+7d 时，5 例患者骨髓的平均嵌合率为70% ，+14d 时，骨髓的嵌合率均超过90% 以上，仅有1 例为88%。在+21d 和+28d ，骨髓嵌合率均达到完全嵌合状态。 【结论】成功建立了STR-PCR 的定量检测方法，并通过5 例allo-HSCT 患者动态 I 观察验证，可以准确地分析嵌合状态的变化。 第二部分 Allo-HSCT 后单个核细胞、T 细胞、粒细胞 植入动力学与aGVHD 关系 【目的】1.观察allo-HSCT 后供者各血细胞的植入顺序； 2.分析三类细胞植入顺序以及其与aGVHD 的关系； 【方法】我院22 例确诊血液系统疾病并接受allo-HSCT 患者，采集供受者移植前、 受者移植后+7 天、+14 天、+21 天、+28 天外周血或骨髓。利用MACS 技术分选出高纯 度的单个核细胞（mononuclear cell MNC ）、CD3+T 细胞、CD15+粒细胞。分别进行 STR-PCR 定量检测供体细胞嵌合率（donor chimerism DC ），同时检测血常规、骨髓细 胞分类、骨髓染色体，并观察疾病相关的临床表现、GVHD 等。 【结果】移植后均顺利造血恢复。在移植后+7d ，T 细胞的植入率（65% ），粒细胞 为（40% ），MNC 为70% ，移植+14d 、+21d 以粒细胞的植入为主，T 细胞植入的略晚于 粒细胞。 在移植后+28 天内，T 细胞达到高比例供体嵌合的 19 例患者，有8 例(42.1 ％)发生 了aGVHD ，其aGVHD 的发生率显著高于+28d T-MC 组。 【结论】1.allo-HSCT 后供者血细胞植入不同步，T 淋巴细胞植入最早，但达到完全 供者嵌合状态(full donor chimcrism，FDC)时间