氧化应激对人角膜上皮细胞中caveolin-1表达的作用.pdfVIP

摘要 摘要 蛋白，高度富集于细胞表面特异性的内陷结构caveolae中。Caveolin．1具有多种 生理功能，除了作为caveolae形成所必须的支撑蛋白以外，它还参与胞吞和胞内 运输，参与信号传导，调节胞内胆固醇、一氧化氮酶的活性、血管平滑肌的增殖， 与心血管疾病、恶性肿瘤地发生密切相关。眼部多种类型的细胞中均可见 caveolin-I的存在并发挥重要的生理作用，但其在人角膜上皮细胞中的分布还没 有相关文献报道，以及缺乏对其功能更深入的了解。氧化应激(OxidativeStress) 是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygenspecies,ROS)和活性氮自由基(reactivenitrogenspecies,RNS)产生过多， 氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。 在眼表疾病中，氧化应激扮演着重要的角色，常常是细胞凋亡以及许多疾病发生 发展的共同通路或者作为一种紧密相关的病理反应存在。角膜是一种无血管的透 明组织，它的抗氧化成分主要依赖于泪膜以及房水，人体血液中的抗氧化剂很难 运输到角膜，因此角膜的抗氧化机制与眼睛的其他组织相比具有其特殊的一面。 而且角膜作为眼球的最外层，直接暴露于空气和光线的照射下，其发生氧化应激 非常普遍，但目前对其的研究却并不清楚。 本实验利用免疫荧光、蛋白印迹技术手段，研究人角膜上皮细胞中caveolin-1 的分布情况，选取过氧化氢作为氧化应激的氧化剂在角膜上皮中建立氧化应激模 型，在这种模型下观测角膜上皮细胞的氧化应激损伤。建模成功后选择合适的过 氧化氢浓度和作用时间点，观测氧化应激前后角膜上皮细胞中caveolin．1蛋白表 达的变化，并选取AKT、MAPK、Wnt等信号通路指标进行观测。 目的：观测人角膜上皮细胞中caveolin．1蛋白的表达、caveolin．1蛋白在角 膜上皮细胞氧化应激前后表达的变化以及产生变化的可能相应机制。 方法：选取正常人角膜组织进行免疫荧光染色，观察caveolin．1蛋白在人角 膜上皮细胞中的表达，并与正常的结膜组织相对照。选取过氧化氢作为氧化应激 反应的氧化剂，选用HCE(人角膜上皮细胞系)通过MTT、ROS、流式细胞检 摘要 测等实验技术建立角膜上皮细胞的氧化应激损伤模型，模型确立之后通过蛋白印 迹法、免疫组化、免疫荧光等实验技术检测氧化应激前后HCE细胞系中caveolin．1 路蛋白检测。 结果：正常人角膜上皮组织的荧光染色可以观察到几乎没有caveolin．1蛋白 在人角膜上皮细胞表达，正常的HCE细胞免疫荧光染色也显示出相同的规律， caveolin．1蛋白仅有微量表达在细胞膜上，细胞浆内几乎没有表达。通过MTr、 流式细胞检测和细胞内ROS检测等实验技术，可以观察到过氧化氢作为氧化应 激的氧化剂可以抑制HCE细胞的生长、诱导HCE细胞的凋亡，过氧化氢刺激后 的HCE细胞内ROS含量与正常HCE细胞相比显著增高。通过HCE细胞的氧化 应激模型可以发现caveolin．1蛋白在HCE细胞内的表达发生了显著的变化：蛋 白印迹技术检测示caveolin．1蛋白的含量较正常HCE细胞明显增加，免疫荧光、 免疫组化也可以观察到caveolin．1蛋自在HCE细胞胞浆内强表达。蛋白印迹技 的HCE细胞中表达增高。 结论：过氧化氢可以在角膜上皮细胞中造成氧化应激损伤的模型，角膜上皮 细胞的氧化应激可以导致细胞凋亡；正常人的角膜上皮细胞不表达或者仅细胞膜 表达微量的eaveolin．1蛋白。在氧化应激的情况下，角膜上皮细胞的胞浆中 MAPK等信号通路的激活有关。 关键词：氧化应激caveolin．1；角膜上皮；活性氧自由基。 Ⅱ Abstract Abstract 21-24kDa membrane the Caveolin·l，a integral protein，isprincipalcomponent has ofeav