深黄被孢霉突变株A35—4产多不饱及脂肪酸发酵条件优化.docVIP

深黄被孢霉突变株A35—4产多不饱及脂肪酸发酵条件优化摘要：以深黄被孢霉（Mortierella isabellina）突变株A35-4为材料，通过单因素试验及正交试验探讨了发酵条件对A35-4产多不饱和脂肪酸的影响。结果表明，突变株A35-4的最佳发酵培养基配方为60 g/L果糖、3 g/L牛肉膏、3 g/L磷酸二氢钾、0.6 g/L MgSO4、2.0 g/L柠檬酸钠、1.0 g/L菜子油，初始pH 6.0，先28 ℃培养4 d，然后20 ℃培养3 d。 关键词：深黄被孢霉（Mortierella isabellina）；多不饱和脂肪酸；优化；发酵 中图分类号：Q815 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1920-04 多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）及其衍生物在大脑发育、过敏反应及心血管运动等一系列生理功能中发挥重要作用，具有维护生物膜的结构和功能、治疗心血管疾病、抗炎、抗癌、促进大脑发育、减肥以及增加动物的产仔率和成活率等生理功能[1-7]。随着人类生活水平的提高，运动量的减少，PUFAs对人类的健康就显得越来越重要。长期以来人们都是从动植物油脂中提取PUFAs，但动植物的生长受到季节、地理位置等的影响而使PUFAs含量变动较大，提取成本高，周期长，不能适应市场的需要，且动植物油脂资源含油量及不饱和脂肪酸类型、比例均受到一定的限制。因此，近年来人们一直在探索利用诱变育种等技术，对现有产PUFAs菌株进行改造，进一步提高PUFAs的含量。开发微生物 PUFAs 可以部分或完全取代动物、植物中的 PUFAs，有着广阔的市场前景[8，9]。 袁成凌等[6]采用不同诱变方法对高山被孢霉（Mortierella alpina）进行诱变育种，获得多株花生四烯酸（Arachidonic acid，ARA）高产菌株，ARA 产量最高达到7.43 g/L，王啸等[10]对深黄被孢霉（As3.2793）进行复合诱变获得突变株MUI0310，ARA 产量为 0.73 g/L。目前产 PUFAs 的出发菌株多为被孢霉属真菌，但由于野生菌株产PUFAs的能力很低，因此急需利用诱变育种等方法培育出高产菌株[11，12]。 在前期研究中，以深黄被孢霉As3.3410为出发菌株，利用微波诱变和紫外诱变，乙酰水杨酸与低温（15 ℃）相结合的筛选方法，获得1株高产多不饱和脂肪酸菌株A35-4[13]，其生物量为17.9 g/L，油脂含量为67.8%，油脂产量为12.12 g/L，PUFAs含量为20.3%，PUFAs产量为2.46 g/L，连续斜面传代培养证实该菌株具有较好的遗传稳定性。本研究探讨了深黄被孢霉突变株A35-4的发酵条件，对其培养基组成和培养条件进行了优化，得到深黄被孢霉突变株A35-4发酵的最佳培养基组成和合适的产脂条件，为工业化生产打下基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 深黄被孢霉突变株 A35-4由购自中国科学院微生物研究所的深黄被孢霉As3.3410诱变筛选得到。 1.1.2 培养基 斜面培养基为 PDA 培养基（土豆琼脂培养基）：200.0 g/L马铃薯，20.0 g/L葡萄糖，20.0 g/L琼脂，于1×105Pa灭菌20 min。种子培养基：100.0 g/L葡萄糖，1.0 g/L磷酸二氢钾，0.3 g/L硫酸镁，2.0 g/L酵母膏，2.0 g/L硫酸铵，pH 6.1，于1×105 Pa灭菌20 min。 1.2 方法 1.2.1 培养方法 摇瓶种子培养：取活化7 d的PDA菌种斜面，用5 mL无菌水洗下孢子，倒入装有50 mL摇瓶种子培养基的150 mL三角瓶中，于28 ℃以180 r/min振荡培养48 h。摇瓶产脂培养：取培养48 h的摇瓶种子培养液2 mL接入装有 100 mL产脂培养基的 250 mL三角瓶中，于28 ℃以180 r/min振荡培养7 d。 1.2.2 分析方法 油脂含量定量分析：索氏抽提法[14]。气相色谱分析： PUFAs含量的气相色谱测定委托中国农业科学院油料作物研究所测试中心完成。 1.2.3 单因素试验 ①温度对突变株发酵的影响。在不同温度（5、10、15、20、25、30、35 ℃）条件下探讨发酵温度对突变株生产和产脂的影响。菌株固定接种量为2%，以180 r/min振荡培养7 d后收集菌体并测量生物量和油脂含量。②碳源对突变株发酵的影响。在基本产脂培养基中分别添加浓度均为100 g/L的葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖和乳糖，配制成含不同碳源的产脂培养基。菌株固定接种量为2%、以180 r/min振荡培养7 d后收集