重组人pro-EMAPⅡ对Saos-2细胞基因的表达调控.pdfVIP

摘 要 新生血管生成，顾名思义就是从现有血管中生长出新的血管。在细胞复制、 伤口愈合和炎症反应等过程中起着重要的作用。这一过程在伤口愈合以及细胞增 殖循环过程中是受到严格控制的。如果这种调控机制受到破坏，就会导致严重的 病理变化，例如风湿性关节炎、牛皮癣以及恶性肿瘤等等。肿瘤的血管生成在肿 瘤的增殖和转移过程中起着重要的作用，通过抑制新生血管的形成和发展来达到 杀伤肿瘤细胞的目的，是一种确实有效的“饥饿”疗法。 近年来的研究表明，pro-EMAPII蛋白是一种有效的新生血管抑制剂。它是哺 乳动物氨基乙酰tRNA合成酶的辅助因子，由312个氨基酸残基组成，分子量为 34kD。实验数据表明其抑癌机制主要为抑制新生血管生成，对于癌症细胞并没有 明显的杀伤作用。研究结果表明，pro—EMAPII蛋白在体外的鸡胚尿囊膜实验和体 model)实验中显示出了良好的新生血管抑制作用， 内异种移植模型(xenograft 对原癌和转移癌具有很好的抑制作用，有望成为治疗实体瘤，如鼻咽癌、前列腺 II蛋白抑 癌、乳腺癌和肺癌的候选药物。近年来的大多数研究主要针对pro—EMAP 制癌症发展和引发炎症反应的宏观作用，对于微观领域的细胞信号传导通路等方 II蛋白具体的作用机制将具有十分 面研究较少，这方面的研究对于了解pro—EMAP 重要的意义。 以表达带有6×His标签融合蛋白的原核表达载体上，并实现了在大肠杆菌中的高 效表达。经过Ni．agarose亲和层析和凝胶过滤层析进行目的蛋白的纯化，蛋白纯度 达98％以上。纯化得到的目的蛋白，作用于内皮细胞进行活性的测定，活性测定 方法主要为内皮细胞迁移实验和管腔形成实验。活性测定实验结果表明， pro—EMAPII蛋白对于内皮细胞的迁移和管腔形成都具有明显的抑制作用。为了研 术，从整体水平研究Saos．2细胞经50 II蛋白刺激8h后，基因表 Ltg／mLpro．EMAP 达谱的差异。结果表明Saos．2细胞中共有39个基因表达上调，29个基因表达下调， 这68个基因中有12个差异基因参与多个信号转导通路。从芯片分析的结果中，我 们发现pro—EMAP 表达。我们用逆转录．聚合酶链式反应的方法对芯片的结果进行验证，结果表明， 所检测的基因受调控的趋势都与基因芯片分析的结果一致。 综上所述，我们获得了纯度达98％以上的pro．EMAPII蛋白，并且通过内皮细 胞的细胞迁移实验和管腔形成实验对pro．EMAPII蛋白的活性进行了测定，又利用 RT．PeR方法验证了芯片的结果。 从细胞活性实验的结果可以看出，我们克隆表达纯化的pro．EMAPII蛋白作为 新生血管生成抑制剂，可以有效的抑制内皮细胞的迁移和血管管腔的形成，从定 量分析和定性分析两方面证明了其抑制效果，表明我们得到的目的蛋白具有应有 的生物学活性，具有通过抑制新生血管生成抑制肿瘤生长的功能。 细胞中基因的表达变化可反映细胞活动的内在规律，基因芯片技术就是研究 这种变化的重要方法，它是分子生物学方法学的一项重大突破，也是目前研究肿 瘤相关基因的最有效手段。本研究采用北京博奥生物有限公司的的人类V2．0全基 因组寡核苷酸微阵列芯片，检测人的基因表达谱，结果表明，在经过pro．EMAP II蛋白刺激后，Saos一2细胞中的绝大部分基因表达并没有发生明显的变化，但也 有少数的基因表达产生了差异，在这些差异表达的基因中，有12个基因参与了多 II蛋白发挥抑制新生血管 个信号转导通路，这12个基因很有可能参与了pro—EMAP 生成作用的信号通路。 pro—EMAP 一定程度的上调。APP又称p淀粉样前体蛋白，是一种具有受体样结构的大分子 膜整合糖蛋白， APP可在人体大多数细胞中表达，主要与神经系统的损伤有关； 与MHCII启动子的结合并增强启动子结合的特异性，能和CIITA一起调控MHC II类分子的表达；CTSB又称组织蛋白酶B，是溶酶体内一种半胱氨酸蛋白酶，当 其在特定条件下释放到胞浆后，