一种快速构建基因多个点突变体方法的建立-生物化学与生物物理进展.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2013, 40(7): 678~685 种快速构建基因多个点突变体方法的建立* ** ** ** *** 陈立涵 李玮妮 张 浩 程 龙 叶棋浓 (军事医学科学院生物工程研究所，北京 100850) 摘要 蛋白质内部多个位点的翻译后修饰在基因的功能调节过程中发挥重要作用，基因的点突变体在其结构和功能研究中发 挥非常关键的作用，因此，高效、快速构建基因的多个点突变体在基因的功能研究中意义重大 本研究在建立了对目的基因 进行高效准确的单点突变方法的基础上，以SRrp53 点突变体的构建为例，设计了新型的以反向PCR 为基础的多个点突变的 实验流程，获得的多位点突变体质粒 测序后均与预期相符，将测序正确的多位点突变体质粒转染293T 细胞后，均表达了 分子质量正确的蛋白质 以上结果表明，该实验设计方案能够高效、方便地用于基因多个点突变体的构建，为进一步研究它 们的分子功能打下了基础 关键词 反向PCR，SRrp53，多位点突变 学科分类号 Q52 DOI: 10.3724/SP.J.1206.20 12.00601 蛋白质的翻译后修饰在基因功能的调节过程中 基化酶处理后进行自身连接 随后以连接后的 发挥非常关键的作用，研究表明，蛋白质分子能够 PCR 产物为模板，用另一对磷酸化的引物进行第 [1] [2] 发生多种形式的修饰，如磷酸化 、甲基化 、乙 二轮的反向PCR 反应，反应结束后将PCR 产物分 [3] [4] [5] 酰化 、泛素化 、类泛素化 等共价修饰，而每一 别 Dpn 处理、胶回收、连接和回收，再以之为 种修饰可能发生在不同位点的相同氨基酸残基上， 模板进行下一轮反向PCR 反应 反应产物 上述 不同位点的同种类型修饰又会产生不同的生物学效 同样方法处理后再进行后续PCR 反应，直至所需 [6-7] 应 ，因此，通过对目的基因进行多位点的点突 突变位点全部突变完毕 将最后的反向PCR 产物 变，以确定其修饰的位置及其相应生物学意义，是 进行Dpn 处理、胶回收、连接并转化大肠杆菌 基因功能研究的必要手 我们曾建立了高效构建 DH5琢 提取质粒进行序列分析后，将发生全部正 基因单点突变体的方法，很大程度地提高了单点突 确突变的质粒转染293T 细胞进行蛋白质表达鉴 [8] 变的速度和准确度 ，但是，如何建立快速对基因 定 本研究旨在建立高效、快速的构建基因多位点 进行多点突变的方法，成为一个绕不开的难题 点突变体方法 为此，我们设计了一个用于在目的基因内部快 速构建多位点突变的方法( 图1)：首先将待突变的 * 北京市自然科学基金(7112 101)和国家重点基础研究发展计划 所有正、反向引物进行磷酸化，再以含野生型目的 (973)(2011CB504200)资助项目. 基因cDNA 的质粒为模板，用其中的一对正反向 ** 共同第一作者. 引物进行反向PCR 反应 PCR 产物 Dpn 处理 *** 通讯联系人. Tel: 010-6693 1830 叶棋浓. E-mail: Yeqn66@ 1 h 后，进行0.7%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带 张 浩. E-mail: zhanghal197@ 用胶回收试剂盒进行回收，将回收产物用dam 甲 收稿日期：2012-12-18，接受