现代分生技术-郑丽实逆.pptVIP

大肠杆菌、质粒和噬菌体郑丽舒 中国疾控中心 病毒病预防控制所2013.04.15;一、大肠杆菌 二、质粒：常见质粒 质粒的分离纯化 感受态细胞 质粒转化 三、噬菌体：λ噬菌体及其载体 M13噬菌体及其载体 四、分子克隆;大肠杆菌;大肠杆菌;大肠杆菌一般特征;Escherich在1885年发现大肠杆菌，广泛存在于人和温血动物肠道中，44.5℃发酵乳糖产酸产气。在相当长时间内认为是非致病菌。20世纪中叶，认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，常引起严重腹泻和败血症。 根据不同生物学特性将致病性大肠杆菌（EPEC）分为4类： 肠产毒性大肠杆菌（ETEC） 肠侵袭性大肠杆菌（EIEC） 肠出血性大肠杆菌（EHEC） 肠黏附性大肠杆菌（EAEC）;大肠杆菌在分子生物学实验中的应用;大肠杆菌在分子生物学实验中的应用;大肠杆菌在分子生物学实验中的应用; 加拿大人Frederick Banting和Charles Best于1921年首先发现胰岛素，1922年开始用于临床，1923年或诺贝尔奖。1965年9月17日，中国科学家第一个在实验室中人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。 人的胰岛素基因在大肠杆菌里指挥着大肠杆菌生产出了人的胰岛素。随着细菌的繁殖，胰岛素基因也一代代传了下去，后代的大肠杆菌也能生产胰岛素。这种带上了人工给予的新的遗传性状的细菌，被称为基因工程菌。 ;大肠杆菌的培养与保存;▲ 取2-5毫升液体LB培养基，到无菌培养管中； ▲ 用接种环从琼脂培养板上挑取单个菌落，接种到培养基中。注意要先蘸取少许液体在管壁将菌落研磨开，再轻摇试管使细菌均匀分散到培养基中； ▲ 盖上盖子，保证通气。37℃摇床 60rpm，培养过夜; ▲ 1:100转种到培养瓶中。通常250ml培养瓶中加培养液不超过100ml。37℃摇床（250rpm）培养，直至细菌生长到所需密度。;◇ 用接种环蘸取少许细菌培养液，或从固体培养平板的菌落上蘸取少许细菌，从平板的一侧开始划线； ◇ 消毒接种环，从刚划过的部位带过并在旁边继续划线； ◇ 如上重复3～4次，直至划满平板。这样可以确保分离出单个菌落。;■ 在小玻璃瓶或试管中加入三分之??体积的LB半固体培养基； ■ 用接种针从固体培养板上挑取单个菌落，反复刺入琼脂中； ■ 置37℃培养8-12小时，直至可看到细菌生长呈雾状； ■ 拧紧盖子，置15-22℃暗处保存。一般可保存数年； ■ 复苏时用接种环蘸取少许带菌琼脂，划线到LB平板上。;■ 取新鲜饱和的或生长到对数生长中期的细菌培养液，加入灭菌的甘油至终浓度15%（或7% DMSO），混合均匀。 ■ 分装到冻存管中，保存在-70℃。如条件所限，亦可保存在-20℃，但保存时间较短。 ■ 复苏时，用接种环从上面刮取少许菌液，注意要避免反复冻融。然后划线到LB平板上。; 质粒（plasmid）是染色体以外能 自主复制的遗传因子 不具有胞外期 对寄主细胞来说是非必需的; 质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（L DNA） ; 常见质粒种类： 细菌质粒 真核生物DNA质粒 真核生物RNA质粒;质粒概述;细菌质粒功能分类 克隆质粒: 克隆一个基因或DNA片断 表达质粒: 用于一个基因的蛋白表达;细菌质粒性质： 1、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；;细菌质粒性质： 2、质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把 质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种； 严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随，一般一个寄主细胞内只有少数几个（1-5）个拷贝； 松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。 pBR322即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。;细菌质粒性质： 3、可以通过转化、转导或接合作用(通过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换的过程 )由一个细菌细胞转移到另一个细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞； 质粒转移时，它可以单独转移，