基因工程3教案.doc

重组DNA的连接、转化和筛选 目的DNA片段与载体的连接 外源DNA片段与载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于： 连接具有同源互补粘性末端的DNA片段； 连接双链DNA分子间的平端； 在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 一般说来，在选择外源DNA同载体分子连接反应的程序时，需要考虑到以下三个因素： 实验步骤要尽可能简单易行； 连接形成的“接点”序列应能被一定的核酸内切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段； 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。 目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种： （一）、具互补粘性末端片段之间的连接 大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。 若外源DNA插入片段和适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。但是，在同源粘性末端连接方案中，存在以下两个弊端：高背景和两向插入。 高背景：连接物中除重组子以外，还有相当数量的载体自身环化分子，这将产生转化菌中较高的假阳性克隆背景。针对这一问题，往往需要在连接前，将切割后的线性载体DNA分子用碱性磷酸酯酶进行5’端去磷酸化处理。 两向插入：由于载体与插入片段之间的末端全为粘性互补顺序，所以插入片段插入载体中存在两个方向。对于原核或真核表达型重组子的构建，反向插入的重组子，由于插入片段的转录及翻译阅读方向与载体启动子转录方向相反，产物的表达困难，或表达出完全不同的产物，故必须筛选出正向连接的重组子。其解决办法是将重组子进行内切酶图谱分析，以鉴定重组子中插入片段的方向。目前，采用所谓的定向克隆技术，可以使外源DNA片段按一定方向插入到载体分子。 定向克隆：根据核酸内切限制酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA片段。十分明显，如果载体分子和待克隆的DNA分子都是用同一对核酸内切酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA片段将按一种取向退火形成重组DNA分子。 互补粘性末端连接方案中还有一个问题：片段的多拷贝插入。当需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼连剪切信号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以需要用内切酶图谱对单拷贝插入片段进行鉴定和筛选。适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般比例为2(1（插入片段摩尔数(载体摩尔数）。 （二）、平末端的连接 载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。实际上有许多情况都是例外的，因为有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的实验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端或平末端；再如用机械切割法制备的DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。 理论上任何一对DNA平末端均能在T4DNA连接酶催化下进行连接，这给不同DNA分子的连接带来了方便。但是，平末端连接更为复杂，且速度也慢得多，因为一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的机会显著减少，通常平末端的连接速度为粘性末端的1/10~1/100。 为了提高平末端的连接速度，可采取以下措施：（1）增加连接酶用量，通常使用粘性末端连接用量的10倍，但是实际操作中，这种方法并不常用，因为酶量加大，反应体系中甘油的浓度也提高，有时对连接反应不利；（2）增加DNA平末端的浓度，提高平末端之间的碰撞机率；（3）加入NaCl或LiCl以及PEG；（4）适当提高连接反应温度，平末端连接与退火无关，适当提高反应温度既可以提高底物末端或分子之间的碰撞机率，又可增加连接酶的反应活性，一般选择20℃~25℃较为合适。 既然在一定反应条件下，用T4DNA连接酶可以将平末端的DNA片段有效地连接起来，那么对于上面提到的非互补粘性末端的两种DNA片段之间，经过专门作用于单链DNA的S1核酸酶处理变成平末端或用大肠