CCK-%2c8-在小鼠神经元信号转导通路的的分析研究.pdf

CCl(8在小鼠神经元信号转导通路的研究 摘 要 目的：在建立细胞傣号转导磷酸化蛋白质组分析方法的基础上，对小 鼠神经元在八肽照囊收缩素(Octapeptide 的信号转譬通路进行初步研究；对信麓转导系统中的组成成分，鞴与信号 转导有关懿酶撤藏蛋邑踵行了翘步鉴定，莠从缨憨整体水平上理察亭孛经元 CCK8信号转导的动力学特征。在此基础上，采用受体拮抗剂L。364718和 L365 260处理神经元，确定CCKs刺激神经冗信号转导的蹙体类型，并初 步勾勒整CCKB型受体介导的胞内信号转导途径。方法：培养酶耨生小鬣 大脑皮质辛孛经元分为CCK刺激组、受体拈抗剂组和对照组，在无磷培养基 20、60、t20 min嚣，倾去培养基，滚氮终止反应，裂解缨臌提取念缨臆蛋 白，Bradford法测定蛋囱含量，双向电泳(一向采用pH4．7的固相pH梯 度(IGP)婷电聚焦，=向采用浓度为lO％的十二烷基磺酸钠．聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS))努离蛋自，凝胶经干胶，放射謇显影7d磊， 在自动洗片机上洗片，获褥磷酸化蛋魏质的双向电泳放射囱显影图谱。受 体拈抗剂组在分别给予不同拮抗剂(10穗mol／L)作用10min后再给于CCK8 (1ff7mol／L)，作用60min，余操作同上。搬据IPG胶条的线性梯度和标 据库和PPDB磷鬣白数据痒中凌询，对小鼠枣申经元CCKs信号转母磷酸化 2D分析软件对双向电泳图谱进行 蛋白质组进行初步分析。采用PDQuest 处理，分析CCKs作用不同时间点一些重要的磷酸化蛋白质磷酸化水平的 改变，绘制国相应的时闻动力学曲线。两时对不同CCK受体拮抗荆作用露 蛋鸯震磷酸纯永平戆改变进嚣了分辑。结果：CCK8俸震不麓时闻鹾，毒睾经 元蛋白质磷酸化状态发生了明显改变。通过对双向电泳图谱中i00多个蛋 白质斑点的定性分析，初步确定了小鼠神经元CCK8信号转导相关磷酸化 和钙／钙调强白依赖性环核苷磷酸二酯酶lA(CNlA)；多种受体，如表皮 生长霞子受体(EP)、生长激素受体(国妖)霸阿片样生长园子受体(，。GFR) 学分析结果显示，主要的信号转导相关蛋白的磷酸化修饰时间动力学曲线 在20 j|褰AKT3蠢60min磷酸傀承平分 mill，pKG多、pKC≮、OGFR、P55G 别达到最大值，以后迅速下降；MK07的磷酸化在5rain达到一定高峰后， 曲线开始下降，但在60 rain min时又达到最大值，盛现双峰型；GBOa则在5 时邸达到最大值，以后开始下降，僵60mill时又毒现第二个小峰；骺P＆魄 燹|』不周，表现巍较持续的激藩状态：CCK刺激5min基磷黢纯承乎霹开始 升高，20min时磷酸化已十分明显，黧120mill时仍处于辩磷酸化状态。 718、L365 分别应用CCKA越、B型受体捺抗剂L-364260作用于神经元， 结果表明，单独作用时二者均可导致CCK8刺激后某些蛋白质磷酸化水平 表明在皮质神经元中同时存在CCK的两种类型受体；加入B型受体特异 拮抗剂L365260后，神经元中多数蛋白质的磷酸化水平降低更为明显(如 定蛋白2(AKA2)、JNK 中CCKB型受体介导的信号转导途径更复杂，且可能占有更重要的地位。 同时应用两种拮抗剂时，与对照组比较并未完全阻断CCK8介导的细胞内 白质组的显著改变；(2)CCKg刺激神经元后，可能通过肌醇磷脂信使系统、 P13K．PKB途径进行信号转导，其效应分子涉及多种生长因子及激素受体， 转录因子，核蛋白等；(3)CCK8刺激神经元的动力学特征表现为细胞内绝 大多数蛋白质磷酸化水平呈现峰形改变，即激活后迅速恢复至低水平磷酸 化状态，表明CCK8在神经元的信号转导具有自适应控制的特征；(4)CCK A型、B型受体均可介导CC磁在神经元的信号转导，但B型受体发挥了 更为重要的作用。其中A型受体通过肌醇磷脂信使系统和MAPK途径进 行信号转导，B型受体通过肌醇磷脂信使系统、cAIVIP依赖的蛋白激酶途 进行信号转导；(5)抑制试验提示在中枢神经系统