氨基酸分析--应用及实践.pdfVIP

氨基酸分析技术的应用与实践 中国农科院饲料研究所 刘庆生 2005年6月28 日 基酸测定方法的基本框架 ‹氨基酸总量的测定(十八种氨基酸) 常规酸水解氨基酸 氧化酸水解测含硫氨基酸 碱解测色氨酸 ‹游离氨基酸的测定 添加氨基酸测定 生物材料 的游离氨基酸测定 蛋白水解氨基酸总量的测定 ‹常规酸水解 测定除色氨酸、含硫氨基酸以 外的蛋白水解氨基酸（15种） ‹氧化酸解 用HBr做终止剂 可测定除色氨酸、酪氨酸、 组氨酸、苯丙氨酸以外的蛋白水解氨基酸 （14种） 用偏重亚硫酸钠做终止剂 可测定除色氨 酸、酪氨酸以外的蛋白水解氨基酸（16种） ‹碱解 测定色氨酸 常规酸水解 ‹原理: 蛋白质是氨基酸以α-氨基和α-羧基形 成酰胺键，共价地结合形成的多聚物。因此 测定氨基酸必须先水解，将氨基酸间的肽键 打开，然后 能分离、测定。该法可测定15 种氨基酸，但含硫氨基酸（主要是胱、半胱 和蛋氨酸）水解 会被氧化，生成多级氧化 产物，难以测准，色氨酸则全部分解为NH 和 3 CO2 ，而无法测定。 ‹基本程序 ‹过程控制 基本程序 称取含蛋白7.5~25mg 的试样 + 10.00mL 6mol/L HCl 在液N2 冷冻,抽真空至≤7Pa -2 (5 ×10 mmHg), 封管 置110±1℃烘箱,水解22~24h 冷却、混匀、开管、过滤 取适量滤液60℃，真空蒸干 加适量样品稀释液, 使各 氨基酸浓度达50~250nmol/mL 混匀,离心或过滤 取上清液, 测定 过程控制 （1 ） ‹酸解法 （常规酸解与氧化酸解-酸解） ‹样品粒度与称样量 样品均一性 谷物氨基酸测定标准：60 目筛，30mg 饲料氨基酸测定标准：40 目筛，100mg ‹氨基酸标准的0.3-2倍 （预先测定粗蛋白含 量）。 ‹对于粗脂肪含量 5%的样品需先脱脂。 过程控制 （2 ） 酸解剂(浓度，添加苯酚） 酸样比 （可在40倍范围内变化） 欧洲：10mgN ：20/500ml 北美：10mg蛋白：2/40ml 水解方式：真空 （充N ）封管/ 回 水解 水解温度与时间 110℃-22h ，135 ℃-4h ，165 ℃-1h 去酸方式 氧化酸解 ‹原理: 样品用过甲酸处理使蛋白质中的胱氨 酸和蛋氨酸分别氧化为磺基丙氨酸和蛋 氨酸砜, 然后酸解,打开肽键形成单一氨 基酸的混合液, 用色谱分离、测定。 ‹基本程序 ‹过程控制 基本程序 含蛋白7.5～25mg 的样品 ＋2mL过甲酸,0℃氧化16h +终止剂 +HBr0.3mL, 静置15min +33.6%偏重亚硫酸钠溶液0.5mL 低于60℃下真空浓缩至干 +7.5mol/LHCl