小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案.docVIP

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案 剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、、0.25%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2 恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% Trypan Blue、抗鼠OX42单克隆抗体和新生SD鼠等 DMEM 10:10:1 DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)? DMEM 5:5:1 DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S? SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS（DMEM/F12无血清培养基+生长因子） 25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine（腐胺），5μg/ml胰岛素， 20 nM hydrocortisone（氢化可的松），20 nM progesterone（孕激素），1％P / S+生长因子（5ng/ ml的血小板衍生生长因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSS DMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)?Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+ ? Laminar flow hood?? Dissecting magnifying glass?? Water bath at 37oC?? Humidified tissue culture incubator (37oC, 5% CO2)?? Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps?? Orbital Shaker (Boeco OS 20)?? Tabletop centrifuge?? 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004)?? T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787)?? Tissue culture plates (Falcon)?? Petri dishes (Sterilin)?? 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech) 2.实验步骤 2.1星形胶质细胞的混合培养 取新生SD鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05%胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO2 恒温细胞培养箱( 37度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。 2.2胶质细胞的分离和纯化 将培养于培养瓶中的混合胶质细胞上清弃去，用0.01mol/L PBS 洗2遍。用无血清培养基0.25%胰酶6 mL 加入培养瓶，37℃ 消化15 min 左右，至镜下观察到大部分星形细胞脱落，将含有星形胶质细胞的消化液立即置于等量含10% FBS DMEM/F12培养基中1000 r/ min离心5 min，再用PBS