局部高温对青春期前大鼠睾丸支持细胞影响及其及生精细胞凋亡关系研究.pdfVIP

（12h:12h）、自由进食饮水。将大鼠随机分为对照组（8 只）和实验组（32 只），实验组按 高温处理后 2 、4 、12 和 24 小时均分成 4 个亚组（n =8 ）。通过对睾丸局部高温（43 ℃水浴 15 分钟）处理，对照组浸于 22 ℃水浴 15 分钟于 24 小时后处死；分别于处理后各时间点 颈椎脱臼处死，收集标本。采用组织化学和免疫组织化学方法，分析高温对青春期前 SD 大鼠睾丸曲细精管细胞形态结构、支持细胞波形蛋白及生精细胞 Caspase-3 蛋白表达与分 布的影响，采用紫外分光光度法检测睾丸组织 Caspase-3 的活性；同时，应用Western blot 蛋白免疫印迹技术定量检测波形蛋白表达情况；采用 TUNEL 法及流式细胞仪检测各组的 生精细胞凋亡情况；采用微粒子化学发光法检测各组睾丸内睾酮含量。 结果： 1. 组织学观察与睾酮含量：处理后 2 h 即可见少量生精细胞脱落至管腔，4 h 组可见大量 生精细胞脱落，生精细胞与曲细精管基底膜之间形成较大空隙；12 h 组可见管腔脱落 细胞消失，生精上皮变薄，生精细胞稀疏、排列紊乱，支持细胞胞质呈空泡样改变； 24 h 损害较 12 h 更为严重，多数管腔可见多核巨细胞。高温作用后睾丸内睾酮含量在 12 h 及 24 h 与对照组比较均减少，其中 24 h 组明显下降（P0.05 ）。 2. 生精细胞凋亡情况： 1）TUNEL 法检测：对照组可见睾丸生精上皮排列完整规则，存在较多的自发性细胞 凋亡，主要集中在精原细胞及部分精母细胞；高温处理 2 及 4 h 后凋亡数与对照组 比较反而减少（P0.01 ），各组凋亡细胞主要定位在初级精母细胞及精原细胞；12 h 组生精细胞凋亡主要集中在生精周期的 Ⅰ~ Ⅳ期（早期）和Ⅻ~ⅩⅣ期（晚期），而 Ⅴ~ Ⅶ期（中期）凋亡少见；24 h 组见大部分曲细精管均出现细胞凋亡，数目明显 增多；12 h 及 24 h 组凋亡指数与对照组比较明显增加（P0.01 ）。 2 ）流式细胞仪检测：对照组可见凋亡峰，高温处理后2及4 h 凋亡峰反较对照组下降， 而在高温处理后12及24 h组，凋亡峰明显升高，甚至成为主峰；高温处理后2及 4 h组亚单倍体细胞百分率与对照组比较降低（P0.05 ），而12及24 h组与对照组 比较明显升高（P0.01 ）（Control: 10.41±1.91，2 h: 7.64±2.78 ，4 h: 7.40±3.25 ，12 h: 20.46±5.13 ，24 h: 30.98±9.96 ）。且 12 及 24 h 组 4C 峰较前几组降低比较明显 （P0.01 ），2C峰变化不明显，1C峰逐渐降低。 3. 波形蛋白（Vimentin ）表达与分布情况： 1）免疫组化：对照组波形蛋染色可见阳性沿基底膜形成棕色的环，并随支持细胞胞质 呈辐射状伸向管腔；2 h 组可见其围绕支持细胞核周表达，与对照组比较伸至管腔 - 2 - 的波形蛋白微丝表达减少或消失；图像分析显示，2 h 组与对照组比较蛋白表达无 明显差异，而 12 及 24 h 组与对照组比较差异显著（P0.01 ）， 4 h 组较 2 h 组蛋白 表达增加（P0.01 ），4 h 组与 12 h 组及 24 h 组与 12 h 组间蛋白表达比较无差异。 2 ）Western blot 免疫印迹法：2 h 组与对照组比较蛋白表达无明显差异，4 h 组较对照 组蛋白表达增加（P0.05 ），而 12 及 24 h 组与对照组比较差异显著（P0.01 ）；显 示各组波形蛋白表达量与免疫组织化学所得结果基本相符。 4. Caspase-3 蛋白表达与分布及活性变化情况：高温处理后在 2 及 4 h 均可见表达，阳性 细胞数逐渐增多，这时仍见大多数表达在胞浆内，主要集中在精母细胞表达，在脱落 于管腔中的精子细胞核周也可见其表达；至高温处理后 12 及 24 h ，在精母细胞和精子 细胞的胞核出现 Caspase-3 强阳性表达，图像分析显示：除 2 h 组与对照组比较染色阳 性细胞 Caspase-3 含量无差别