甲羟戊酸对人系膜细胞增殖及p38MAPK信号通路影响.pdfVIP

山西医科大学焉士学位论文 刖 再 肾小球肾炎的发病机制及防治一直是肾脏病研究领域的重要课题。在肾小球炎症状 态下系膜细胞(Mesangialcell，MC)活化，表现出活跃的增殖状态。MC过度增殖及细胞外基 质增加导致系膜区增宽、毛细血管袢受压、肾小球滤过率下降。活化的MC还可以释放许 多与炎性反应有关的生物活性物质，包括生长因子、细胞因子、反应性氧族等。这些因子 可趋化单核细胞、淋巴细胞并促使它们释放炎性介质进一步激活MC，使局部炎症不断放 大并形成恶性循环，加速肾小球硬化。MC释放炎症介质同MC过度增殖一样在肾炎的发 生、发展及肾小球硬化中具有极其重要的作用，因此探讨影响MC增殖和炎症介质释放的 因素及其机制对于治疗肾炎、防止肾小球硬化显得尤为重要。 acid， 甲羟戊酸(MevalonicMev)是胆固醇合成代谢的中间产物。在胞液内一系列酶 的催化下，脱羧磷酸化生成异戊烯焦磷酸酯和二甲基丙烯焦磷酸。再缩合成焦磷酸法尼酯，除 合成胆固醇外，还合成GGPP和异戊烯化蛋白等。Mev及其衍生物是真核细胞一系列生物活 动的关键。是细胞由GI．S期转化，完成DNA合成所必须的。Mev的非胆固醇代谢产物异戊烯 焦磷酸，如FPP和GGPP是一系列蛋白翻译后修饰所必须的，尤其是小GTP结合蛋白，异戊烯化 后的蛋白才能定位于细胞膜，引起Raf蛋白激酶活化，进而通过级联反应引起MAPK通路活 控细胞凋亡、介导炎性反应、诱导上皮细胞转分化等作用。p38MAPKJI匝路下游表达的蛋白 细胞受到凋亡刺激时是生存还是死亡，Bcl一2蛋白占优势时细胞趋于存活；Bax蛋白占优势时 细胞趋于凋亡pJ。 本实验拟在从细胞水平研究Mev对人系膜细胞(Humancell，I-talC)增殖、纤 Mesangial HMC增殖及下游效应蛋白表达的影响。为临床预防和治疗系膜增生性肾炎提供理论和实 验依据。 材料与方法 1．I实验材料 1．1．1实验所用HMC细胞株由中国协和医科大学惠赠。 1．1．2．实验使用主要试剂： PRMI 1640培养基(杭州四季青公司) PBS(杭州四季青公司) 二甲基亚砜(DMSO)(杭州四季青公司) 胰蛋白酶(Trypsin)(杭州四季青公司) 甲羟戊酸(Mevalonic acid，Mev)(Sigma公司) 13一actin(进口分装) 细胞裂解液(进口分装) Marker(上海森雄公司) P-p38MAPK(鼠抗人)(ABEAM公司) SB203580(Axxora公司) 抗鼠的二抗(兔抗鼠)(进口分装) N，N，N，N．四甲基乙二胺(TEMED)(进口分装) 鼠抗人Bcl．2蛋白单克隆抗体(ABCAM公司) 人TGF-13Elisa试剂盒(Bender公司) 鼠抗人Bax单克隆抗体(ABCAM公司) 1．1．3．实验使用主要仪器： 超净工作台(德国Heraeus公司) 二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司) 倒置相差显微镜(Olympus)(日本OLYMPUS公司) 超低温高速离心机(5810R(EppendrofGerm) 50ml培养瓶(杭州四季青公司) 96孔，24孔培养板(杭州四季青公司) 1．2实验方法 1．2．1细胞培养方法 HMC 霉素100mg／L的RMPI 消化，3—4天传代1次。 1．2．2 Mev对HMC增殖的影响 选对数生长期的HMC，0．25％的胰蛋白酶消化，接种于96孔培养板，每孔细胞数约 2 山西医科大学焉士学位论文