第6章沉淀反应(kyhs).pptVIP

第六章　沉淀反应 抗原抗体反应类型 　 凝集反应　　颗粒性抗原 沉淀反应　　可溶性抗原 补体结合反应 　　　　　细菌抗原　　溶菌反应 　　　　　红细胞抗原　溶血反应 中和反应　　毒素抗原　 沉淀反应（precipitation） 是可溶性抗原与相应的抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象 第一阶段　Ag+Ab→AgAb　 特异性可溶性的反应 第二阶段 nAgAb→AgAbn　 大分子肉眼可见的沉淀现象 1898年Kraus　　 毒素－抗毒素的沉淀现象 1905年Bechhold　沉淀反应可在凝胶中进行 1946年Oudin　　 试管免疫扩散技术(定性) 1965年Mancini　 单向免疫扩散技术(定量) 20世纪70年代　免疫浊度法(进入自动化阶段) 第一节　沉淀反应的特点 第二节　液体内沉淀试验 絮状沉淀试验 免疫浊度测定 环状沉淀试验 标记免疫技术 第三节　凝胶内沉淀试验 单向扩散试验 Oudin Manicini 双向扩散试验 Okley Ouchterlony 免疫电泳技术 第四节　沉淀反应的应用 第一节　沉淀反应的特点 可溶性抗原 特异性 比例性 可逆性 阶段性　　速率比浊　　终点比浊 沉淀反应分两个阶段，第一阶段发生抗原抗体特异性结合，第二阶段形成可见的免疫复合物 经典的沉淀反应在第二阶段观察或测量沉淀线或沉淀环等来判定结果，称为终点法 免疫浊度法则在第一阶段测定免疫复合物形成的速率，称为速率法 现代免疫技术（如各种标记免疫技术）多是在沉淀反应的基础上建立起来的，因此沉淀反应是免疫学方法的核心技术　 第二节　液体内沉淀试验 一、絮状沉淀试验 二、免疫浊度测定 三、环状沉淀试验 一、絮状沉淀试验 絮状沉淀试验历史较久，且实用 方法要点是：将抗原与抗体溶液混合在一起，在电解质存在下，抗原与抗体结合，形成絮状沉淀物 受抗原和抗体比例的直接影响，因而产生了两种最适比例的基本测定方法 1.Ag稀释法（Dean-Webb法） 将可溶性Ag作系列稀释，与恒定浓度的抗血清等量混合,RT或者37℃反应,产生的沉淀物随Ag浓度改变而变化. 目的：确定与恒量Ab反应的最佳Ag量 最适比 表1　Dean-Webb定量沉淀试验(以牛血清白蛋白为例的实验结果) (mmol/L) 2.Ab稀释法――（Ramon）法 恒定量的Ag，与系列不同程度稀释的Ab反应，计算结果同上法 目的：确定与恒量Ag反应的最佳Ab 量 可得出Ab结合价和最适比 3.棋盘格法 获得抗原与抗体的最佳比例 将以上两法相结合 即抗原和抗体同时稀释 称为棋盘格法（亦称方阵法） 找出最佳配比 表2　方阵最适比测定 二、免疫浊度测定(immunoturbidimetry) 光学测量仪器、自动化分析仪器应用于沉淀反应 定量检测：微量抗原、抗体，药物，小分子的半抗原 1959年Schultze　透射比浊法 (transmission turbidimetry) 1967年Ritchie 散射比浊法 (nephelometry) 1977年Sternberg 速率散射比浊法(rate nephelometry) 经典的沉淀试验有4个不足之处 操作繁琐 敏感度低（10～100μg/ml） 时间长 难以自动化 70年代出现了微量免疫沉淀测定法 免疫透射浊度测定 免疫散射浊度测定法 免疫胶乳浊度测定 这3种技术皆已常规用于多种临床体液蛋白的检测，并已创造出了多种自动化仪器 免疫浊度测定 基本原理 Ag、Ab在特殊缓冲液中快速形成复合物，使反应液出现浊度 当反应液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出被检物的含量 免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可以分为两种 透射比浊仪测定（transmission turbidimetery measure） 散射比浊仪测定（nephelometry measure） 透射比浊法 1959年 Schultze 透射光线减少，光线被IC吸收 散射比浊法 1967年 Richie 检测散射光的强度 透射比浊法是测量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其读数以吸光度A表示 散射比浊法是测量入射光遇到质点（复合物）后呈一定角度散射的光量，该散射光经放大后以散射值表示 浊度测定的弱点 Ag或Ab量过剩时易出现可溶性复合物，造成测定误差，测定单克隆蛋白时更易出现 应维持反应管中Ab量始终过剩，这个值要预先测定，使仪器的测定范