SELDI-TOF-MS法地分析体外培养人膀胱癌细胞株BIU-87细胞培养液蛋白质谱变化和化疗药物对其影响.pdfVIP

2．2MMC、EPI对BIU．87作用浓度的选择 2．2．1配制含MMC的细胞培养液 酋先将2mg 3()mg／L，l50mg／L。 2．2．2配制含EPI的细胞培养液 首先将10mg 30mg／L，l50mg／L。 2．2．3体外细胞抑制实验(MTT)比色法 每4L200“l，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。 ②甩扳后，各孔分别加入上述浓度MMc和EPI的培养液，每个浓度设3个复孔，对照 u1，37℃， 组以设3个复孔仅加完全培养液，再过20h后每孔加入MTT溶液(5mg／m1)20 继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。 IJ (D每孔加入ljo 在酶标仪上测定各孔光吸收值(oD值)，记录结果。抑制率=(1--OD自／oD。)X100％。各浓度 的oD值取3个复孔的平均值。分别计算EPI和MMC的IC。。 2．3细胞分泌蛋白的收集 2．3．1细胞培养 培养箱中培养24h。 2．3．2药物作用的方法 并将另一空白培养液装入1个培养瓶中，以相同条件放入培养箱中，同样时间相同方法提 取标本。 2．3．3细胞培养液的收集 于4℃以1000r／min离心10分钟离心：吸取上清液分装成每管100p1，做好标记，置于 -80。C保存。样品的准备融解冰冻培养液上清液，每个样品取20ul。分别置于1．5ml离心 管中。 2．3．4样本的处理 pH9．O)使蛋白 1变性后的样品，每管加入240ll 变性：取20ll l缓冲液(U9缓冲液9倍稀释而成)，40振 荡20min。 5 2．4|MAC．3．Cu操作步骤 ①小心取出IMAC一3一Cu芯片，在芯片背后标记时闻，芯片种类，标本号等资料(注 意4i要触及：签片表面)。 ul的lOOm8 ②每个加样点上10 CuS0．溶液盖住芯片上的加样点，放入湿盒10min， 墩…后在F净纸上，将CuS(L甩于。重复操作一次。 @将芯片放入盛行去离于水的试管I}I。j}j力振荡符fi次，取m后甩f：。 ④每个加样点上加lO“l的醋酸钠(50洲，PH4)溶液，盖住芯片卜的加样点，放入湿 盒确in。 ⑤取出后甩f，放入盛有去离子水的试管中，用力振荡若干次。取出后甩f。 凉十备用。 buffer) ⑦用结合缓冲液(o．05％Triton，250mMNaCl的PBS或试剂盒中的binding 200p 每4LiJtl 中的液体(注意不要甩的太干)，再加入200p 1，重复操作一次。 f：样(剂量为100u (D 1)置振荡器器4C，振荡l小时混匀沉淀后加样，并注意气 泡。 ⑨甩去样品后将样品甩入预装消毒剂的EP管中。 @用结合缓冲液(同前)，每空加上200u 去孔中液体(注意不要摔得太干)，再次加入结合缓冲液200ul，迅速甩干。 grade)200p1，迅速甩干。取80肛l100％乙氰(ANC)和 ①加入去离子水(HPLC 1％的TFA 取E清后备用。取出芯片后，待微干后，在每个加样孔加SPAO．5pl，重复一次。待干后， 即可上机测定。 2．5数据采集和结果分析 蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSII-C型读取数据。仪器参数设置如下： (D激光能量195； (D检测灵敏度8： ④飞行时间信号自动收集。在每次实验数据收集前，用A11-in-one蛋白芯片校正仪 器，使之误差O．1％。 以质量控制蛋白质芯片做重复性检测，其峰值的大小及其强度的变异系数(CVS)均控