C-myc反义寡核苷酸对重新表达FHIT基因结肠癌细胞增殖和凋亡作用影响.pdfVIP

材料和方法 1 材料 1.1 主要试剂的配制 1）培养基的配制：以800ml 新鲜的去离子水，溶解 DMEM 干粉一小包，加入 NaHCO 2g ，充分搅拌混匀后定容至1000ml，用0.45 微孔滤膜和0.22µm 微孔滤 3 膜滤器过滤除菌，PH 值调至7.2-7.4 ，分装，4 ℃保存，一月内使用。 小牛血清56℃水浴30 分钟灭活，-20℃保存。青霉素和链霉素在无菌操作台 内以无菌生理盐水溶解，分装，-20℃保存。临用时加入 DMEM 液中配制成含 10%新生小牛血清及 100µmoL/mL 青霉素、100µmoL/mL 链霉素的DMEM 培养 液。 2 ）PBS ：Nacl 8.0g ，Kcl 0.20g ，Na HPO ·H O3.47858g、KH PO 0.20g 混合后 2 4 2 2 4 加入去离子水800ml，充分溶解，定容至1000ml，分装，高压消毒， 4 ℃保存。 3 ）胰蛋白酶：将0.25g 的胰蛋白酶粉容于100mlPBS 中，4℃冰箱过夜，然后经 0.22µm 微孔滤膜过滤除菌，分装后4 ℃冰箱保存。 4 ）冻存液：新生小牛血清9ml 和DMSO1ml 混合，一周内使用 5 ）MTT 溶液的配制：称取MTT50mg 溶解10mlPBS 中，置于电磁力搅拌器搅拌 30 分钟后，用0.22 µm 微孔滤膜过滤除菌后,分装后4℃避光冰箱保存，两周内使 用。 6 ）LB培养基：Trysptone 1.0g,Yeast extract 0.5g,NaCl 1.0g加入去离子水至100mL， 高压蒸汽灭菌。 7 ）LB 固体培养基：Trysptone 1.0g,Yeast extract 0.5g,NaCl 1.0g,琼脂粉 1.5g加入 去离子水至100mL，高压蒸汽灭菌。 8 ）AO/EB染液：吖啶橙（AO ），溴化乙啶（EB ）分别用PBS溶解成100µg/mL的 工作液，分装，4℃闭光保存，可长期使用。使用前按1：1混合。 9 ）40 ％Acr/Bic ：丙稀酰胺（Acr ） 37.5g 、甲叉双丙稀酰胺（Bic ） 1g 、超纯水 至 100ml ，37℃下溶解后，4 ℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 10) 10％过硫酸胺（AP ）:过硫酸胺1g、超纯水10ml，溶解后EP管分装，4 ℃保存。 7 11）30%聚丙烯酰胺（pH7.0 ）配法：丙烯酰胺29g 、N,N-亚甲双丙烯酰胺1g、溶 入60ml去离子水中（棕色瓶），37℃溶解，定容至100ml。 12）Tris·Cl(pH8.8)配法：Tris18.15g、去离子水80ml，HCl调pH至8.8，定容至100ml， 4 ℃保存。 13）Tris•Cl(pH6.8)配法：Tris6.05g、去离子水30ml、HCl调至6.8，定容至50ml， 4 ℃保存。 14）10℅SDS配法：去离子水80ml、电泳级SDS10g、置水浴箱，加水定容至100ml。 15）单去污剂裂解液：1mol/L Tris·HCl （pH8.0 ） 2.5ml 、NaCl 0.438g 、TritonX －100 0.5ml 加蒸馏水至 50ml ，混匀后，4 ℃保存。使用时，加入PMSF至终浓 度为100µg/ml （0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50µl）。 16）G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）：考马斯亮蓝G250 100mg、95 ％ 乙醇 50ml 、磷酸 100ml加蒸馏水至 1000ml ，配制时，先用乙醇溶解考马斯亮 蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4 ℃保存。 17）100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA ）：BSA 0.1g 、0.15 mol/L NaCl 1ml 、溶 解后，－20 ℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成 1mg/ml，－20 ℃保存。 18）分离胶和浓缩胶：10％分离胶（两块胶，10ml） 4 ％浓缩胶（两块胶，5ml ） 超纯水